弥漫性轴索损伤患者的血清NF-L表达变化

史立信，胡福广，顾春雷，王冰，张文超，王传海

弥漫性轴索损伤患者的血清NF-L表达变化

史立信1，胡福广2，顾春雷3，王冰4，张文超1，王传海1

目的：探讨弥漫性轴索损伤（DAI）患者血清中的神经丝蛋白轻链多肽（NF-L）的浓度与DAI病情的严重程度和预后的相关性。方法：选择DAI患者95例（DAI组）和健康体检者65例（正常对照组），采用ELISA检测2组血清中NF-L的浓度。结果：损伤后7 d内，DAI组血清中NF-L的浓度均高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。ROC曲线显示血清NF-L浓度＞3.85 ng/mL对于辅助诊断DAI的敏感性与特异性最高。DAI死亡患者血清NF-L浓度明显高于存活患者。结论：血清NF-L浓度与DAI损伤严重程度及患者预后具有相关性。关键词 神经丝蛋白轻链多肽；弥漫性轴索损伤；特异性；准确性

弥漫性轴索损伤（diffuse axonal injury，DAI）的基本病变包括神经轴索的弥漫性损伤，胼胝体及上脑干背侧局灶性损伤，即DAI三联征[1]。DAI患者最突出的临床特点是伤后原发性昏迷，表现为去大脑强直或去皮质强直，意识恢复较慢[2]，约占重型颅脑损伤的28%～42%，在死亡患者中占29%～43%。病情危重，病死率和致残率高，是导致颅脑损伤患者神经功能障碍、植物状态和死亡的主要原因[3-5]。目前DAI的诊断主要依据临床表现、影像学特征，但CT及MRI的特异性及准确性不高，所以寻求颅脑创伤后DAI发病过程中的生物标志物的变化进行早期诊疗[6-10]，以期改善患者预后。本文研究DAI发病过程中血清神经丝蛋白轻链多肽（neurofilament light polypeptide，NF-L）的表达、变化，对其在DAI诊断、预后判断中的价值进行分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月1日至2015年1月1日清河县人民医院神经外科收治的颅脑创伤后DAI患者95例为DAI组，男28例，女67例；年龄12～74岁；格拉斯哥昏迷评分（Glasgow coma scale，GCS）评分3～5分58例，6～8分 37例；格拉斯哥预后分级（Glasgow outcome scale，GOS）1级（死亡）13例、2级（植物人状态）0例、3级（重残）45例、4级（中残）24例、5级（轻残）13例；DAI程度分级1级21例、2级32例、3级42例。另选取同期在本院常规体检的健康人65例为对照组，男44例，女21例；年龄18～61岁。2组性别、年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究经医院伦理委员会审查批准，所有受试者签署知情同意书。

1.2 实验器材

Kayto RT-6000酶标仪、Kayto RT-3000洗板机、Ketong恒温箱及TOSHIBA全自动生化分析仪均借用于本院检验科。NF-L酶联免疫吸附试剂盒购自北京博奥生物技术公司。

1.3 方法

对照组采集静脉血，DAI组受伤8 d内每隔12 h采集外周静脉血低温保存，检测血清中NF-L含量。包被：用0.05 mol/L pH9的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/mL，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。加样：加一定稀释的待检样品0.1 mL于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1 h，然后洗涤（同时设置空白孔、阴性对照孔及阳性对照孔）。于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标NF-L单克隆抗体（经滴定后的稀释度）0.1 mL，37℃孵育0.5～1 h，洗涤。于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 mL显色，37℃10～30 min。于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 mL终止反应。在酶标仪上进行结果判定，NF-L浓度检测临界点为29 ng/L，检测范围为100～10 000 ng/L。如果检测结果超过该浓度范围，则对待测标本经过浓缩或稀释后重新检测3次，最后取平均值作为结果。

1.4 统计学处理

采用SPSS18.0软件进行统计学分析，χ2检验、ROC曲线，用单因素回归模型分析NF-L在DAI诊断与预后中的价值，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DAI组NF-L浓度的变化

损伤后7 d内，DAI组血清中NF-L的浓度均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；在损伤6 h时NFL浓度值高达（5.33±1.10）ng/mL，在24 h时达（2.10± 0.42）ng/mL，36 h后便迅速下降（图1）。

图1 2组血清中NF-L浓度比较

2.2 血清NF-L在DAI诊断中的价值

根据ROC曲线分析和正确诊断指数（Youden指数）最大截断点原则，用NF-L诊断DAI的曲线下面积为 0.912，95%置信区间为 0.901～0.943（P＜0.01），Youden最大值为 0.66，所对应的血清 NF-L为3.85 ng/mL，此为NF-L在DAI中的最佳诊断界点，此时灵敏度为82.73%，特异度为84.81%，阳性预测值为88.34%，阴性预测值为82.36%，漏诊率为17.27%，误诊率为15.19%（图2）。根据该曲线可知，血清NF-L浓度＞3.85 ng/mL可辅助诊断外伤后DAI的诊断，其敏感性与特异性最高。

图2 血清NF-L对DAI的诊断效能ROC曲线

2.3 血清NF-L浓度与DAI严重程度的相关性

DAI组中，DAI1、2、3级患者的血清NF-L浓度分别为（1.21±0.02）、（2.79±0.13）、（4.53±0.03）ng/mL，DAI2、3级患者的NF-L值均明显高于1级患者，差异有统计学意义（P=0.003，P=0.01）。

2.4 NF-L与DAI组死亡患者结果的相关性分析

DAI组中，7 d内的死亡患者和存活患者在受伤后6 h血清中NF-L的浓度分别为（8.42±2.51）、（1.00± 0.21）ng/mL，前者明显高于后者，差异有统计学意义（P=0.01）。单变量回归分析发现，DAI组血清NF-L＞5.22 ng/mL是预测DAI死亡风险的独立因子（表1）。

3 讨论

近年来人们发现了许多与颅脑创伤后相关的生物标记物[11,12]，它们在DAI的发生、发展过程中有明显变化，且与病情的发展及预后有一定的相关性[13]。理想的生物学标记物需要满足以下条件：对颅脑创伤的特异性和敏感性高；能反映损伤的严重程度；在体液中快速表达；能反映损伤机制；能监测疾病的进展及对治疗的反应；能对预后进行评估[14]。

DAI时神经元发生轴索断裂、分解等损伤，脑白质纤维受损后的生化级联反应和修复反应过程中会出现多种蛋白质的变化，它们与DAI的发生紧密相关，对早期诊断DAI及制订治疗策略有重要意义[15,16]。神经微丝属于中间丝蛋白家族的第Ⅳ类成员，特异地在神经细胞内表达，NF是神经元中直径10 nm的中间丝，是神经元细胞骨架的主要成分，负责轴浆运输，在维持神经元正常形态中发挥着重要的作用。NF分为3种亚型，即轻链蛋白（NF-L，分子量为68 kD）、中链蛋白（NFM，分子量为160 kD）、重链蛋白（NF-H，分子量为200 kD）[17]。NF的结构变化是轴索损伤最早、最有特征性的表现形式，它是轴索肿胀的始动因素[12]。NF-L在神经元中含量最丰富，其活性的改变与神经变性疾病密切相关[18,19]。NF-L是对DAI最敏感的亚基，伤后0.5～2 h即可在脑脊液中检测到其降解产物[20]，并且脑脊液中NF-L的浓度亦会明显升高[14]。其病理生理基础为：DAI后NF-L发生异常磷酸化、减缓NF-L自细胞体向轴突的运输，轴突断裂后，断端回缩可引起磷酸化的NF-L从轴突向细胞体逆流，导致NF-L在细胞体内异常聚集，使损伤神经元细胞体的NF-L含量增加、浓度升高[21]。

本文结果显示DAI发生后很早就能检测出NF-L，DAI组血清中NF-L浓度明显高于对照组，并与损伤严重程度和死亡风险相关。在DAI后血清中还存在NFL浓度第2个小高峰（图1），这可能与颅脑创伤后继发的颅内高压或低氧血症有关。

本文通过绘制ROC曲线的统计学方法发现，血清NF-L浓度＞3.85 ng/mL对DAI诊断的特异性和敏感性最高，这与国外实验结果相符[22,23]。同时发现，DAI后12 h内血清NF-L的升高与患者DAI严重程度明显相关，这与通过入院时GCS评分所的结果一致；并且患者DAI后3月内的死亡率还与受伤6 h内血清NF-L的升高及本研究期内的平均值显著相关。笔者推测在神经元损伤后，NF-L进入细胞外液，再通过受损的血脑屏障入血直至达到平衡[24]，所以血清NF-L能准确反应脑组织、神经元及血脑屏障的损伤程度，判断DAI的预后、预测死亡方面具有重要的参考价值。

本文的不足之处在于，样本量偏小，在后续研究中应扩大DAI患者的数量；实验中对DAI病情的判断主要依靠入院时GCS评分和随访中GOS评分，主观性偏强，今后研究中应该尽量多地采用基于MRI、CT等客观检查的病情判断手段。

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（本文编辑：王晶）

Expression Changes of Serum NF-L Levels in Patients with Diffuse Axonal Injury

SHI Li-xin1, HU Fu-guang2,GU Chun-lei3,WANG Bing4,ZHANG Wen-chao1,WANG Chuan-hai1.1.Department of Neurosurgery,People’s Hospital of Qinghe Country,Hebei 054800,China;2.Department of Neurosurgery,The second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 054800,China;3.Department of Neurosurgery,The Center Hospital of Qinghe Country,Hebei 054800,China;4.Teacher Education School of Qinghe Country,Hebei 054800,China

Objective:To investigate the correlation between the concentration of neurofilament light polypeptide(NF-L)in serum of patients with diffuse axonal injury(DAI)after brain trauma and the severity and prognosis of DAI disease.Methods:Total 95 patients with DAI(DAI group)and 65 patients with healthy physical examination(Normal control group)were enrolled.ELISA was used to detect the concentration of NF-L in the serum and CSF of the two groups.Results:The serum NF-L concentration in DAI group was significantly higher than that in the normal control group within 7 days after trauma(P＜0.05).ROC curves showed that the sensitivity and specificity was the highest for the auxiliary diagnosis of DAI when the serum NF-L concentration was higher than 3.85 ng/mL.The serum NF-L concentration of DAI patients was significantly higher in the dead patients than that in the survivors.Conclusion:The serum NF-L concentration was correlated with the severity of DAI damage and the prognosis of the patients.

R741；R684

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.04.012

1.河北省清河县人民医院神经外科河北 清河 054800

2.河北医科大学第二医院神经外科河北石家庄 050000

3.河北省清河县中心医院神经外科 河北 清河 054800

4.河北省清河县教师进修学校河北 清河 054800

邢台市科技支撑计划项目（No.2016ZC143）

2015-12-15

史立信wbslx8099@163.com