一测多评法同时测定胃力康颗粒中7种成分的含量*

柴士伟，屠亚茹，王兴蕊，刘二伟，常艳旭，何　俊，3

（1.天津中医药大学，天津　300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津　300193；3.天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津　300193）



一测多评法同时测定胃力康颗粒中7种成分的含量*

柴士伟1，2，屠亚茹1，王兴蕊1，刘二伟1，常艳旭1，何俊1，3

（1.天津中医药大学，天津300193；2.天津中医药大学第一附属医院，天津300193；3.天津市现代中药重点实验室-省部共建国家重点实验室培育基地，天津300193）

摘要：[目的]建立可用于胃力康颗粒中7种成分含量测定的一测多评法。[方法]采用超高效液相色谱（UPLC），以芍药苷为内参物，确定芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸的相对校正因子，通过相对校正因子计算各成分的含量；同时比较10批胃力康颗粒一测多评法的计算值与外标法测定结果的差异。[结果]建立了胃力康颗粒中7种成分一测多评的含量测定方法，10批胃力康颗粒中7种成分采用一测多评法测定与外标法测定结果无明显差异。[结论]本实验建立的一测多评法可用于胃力康颗粒中7种成分的含量测定，方法快速、准确，可用于胃力康颗粒的质量控制。

关键词：胃力康颗粒；一测多评法；超高效液相色谱法；质量控制

胃力康颗粒由柴胡、赤芍、枳壳、木香、丹参、延胡索、大黄、甘草等12味药材组成[1-2]，具有行气活血，泄热和胃的功效，适用于胃脘疼痛、胀闷、泛酸、灼热、嗳气、暴躁易怒、口干口苦等症[3-6]。作为临床常用中药[7-10]，胃力康颗粒化学成分复杂，现行标准仅以芍药苷[11]作为其质量控制指标难以全面、客观的反映药品的内在质量。本研究采用超高效液相色谱法[12-14]，以芍药苷为内参物，建立胃力康颗粒中7种成分（芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸）同时测定的“一测多评法”，可快速、全面、准确的控制其产品质量。

1　仪器与材料

1.1仪器Waters Aquity超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；AX205型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli -Q超纯水制备仪（Millipore公司）；Tomos 2-16 A型高速离心机（上海托莫斯科学仪器有限公司）；SB-1000YDTD超声清洗槽（宁波新芝生物科技有限公司）。

1.2材料甲醇为色谱纯，购自Fisher公司；超纯水为Milli-Q制备；芍药苷（批号110736-200731）、芦丁（批号11022LD01）、柚皮苷（批号110722-200610）购自中国药品生物制品检定所；迷迭香酸（批号20140722）、丹酚酸B（批号：20121033）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号W14-7-0）、甘草酸（批号20121098）购自天津一方科技有限公司。

胃力康颗粒购自四川绿叶宝光药业股份有限公司，共10个批次。

2　方法与结果

2.1色谱条件色谱柱为Waters Aquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱，洗脱程序为0～2 min，3% A；2～11 min，3%～36% A；11～13.5 min，36%～41% A；13.5～17 min，41%～54% A，17～18 min，54%～62% A；18～23 min，62%～80% A；23～24 min，80%～3% A；流速0.4 mL/min；检测波长为254 nm；柱温30℃；进样量3 μL。

2.2对照品溶液的配制精密称取芍药苷、丹酚酸B对照品各5 mg，用甲醇分别配制成终浓度为5 g/L对照品溶液；精密称取芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷对照品各2.5 mg，用甲醇分别配制成终浓度为2.5 g/L对照品溶液。精密称取甘草酸对照品2.5 mg，用50%的甲醇溶液配制成终浓度为2.5 g/L对照品溶液，所有对照品溶液储存于4℃冰箱备用。

精密量取上述各对照品溶液适量，用甲醇配制成芍药苷、丹酚酸B为500 mg/L和芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸为

250 mg/L的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备精密称定胃力康颗粒样品0.20 g置10 mL容量瓶中，加入纯水定容至刻度，超声15 min，冷却，用纯水补足溶液至刻度，摇匀，取1 mL该溶液，14 000 r/min离心10 min，取上清用于分析。

2.4方法学验证

2.4.1标准曲线及线性范围精密量取上述混合照品溶液，用甲醇稀释2、5、10、25、50、125、250倍得7个浓度的混合对照品溶液，取各个浓度上述溶液，进样3 μL分析，以色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1。在该色谱条件下，芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的最低检测限分别为0.67、0.33、0.33、0.33、0.67、0.33、0.33 mg/L，最低定量限分别为1、0.5、0.5、0.5、1、0.5、0.5mg/L。胃力康颗粒样品及混合对照品UPLC色谱图见图1。

表1　胃力康颗粒中7种成分的标准曲线Tab.1 Equation of linear regression of seven analytes

图1　胃力康颗粒样品(A)和混合对照品(B) UPLC色谱图Fig.1 The UPLC chromatogram of Weilikang granules (A) and standard solution (B)

2.4.2精密度实验取胃力康颗粒（批号1304021），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，以各色谱峰峰面积值计算相对标准偏差，结果芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的峰面积RSD值分别为0.22%、0.25%、1.34%、1.34%、0.32%、0.33%和0.20%，表明方法精密度良好。

2.4.3重复性实验取同一批号胃力康颗粒（批号1304021），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液并进行测定。计算得芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的RSD分别为0.60%，0.95%，2.02%，1.85%，0.58%，1.65%，和0.77%，表明方法重复性良好。

2.4.4稳定性实验取同一批胃力康颗粒样品（批号1304021）制备的供试品溶液，分别于室温条件下放置0、2、4、6、8、24 h进行测定，芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的峰面积RSD值分别为0.99%，1.38%，1.09%，0.80%，0.38%，1.04%，0.66%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.5加样回收率实验取已知含量的胃力康颗粒样品（批号1304021）0.1 g共6份，分别精密加入一定量的各对照品溶液，氮气吹干。按“2.3”项下方法制备溶液，进行测定。计算芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹参酚B、大黄素-8-O-β-D吡喃葡萄糖苷、甘草酸的加样回收率和RSD值，结果见表2。

表2　加样回收实验结果Tab.2 The recovery rate of seven effective components in Weilikang granules

2.4.6相对校正因子的计算相对校正因子（RCF）计算公式为fsi=（As/Cs）/（Ai/Ci），其中As、Cs分别为内参物对照品s的峰面积和浓度，Ai、Ci分别为待测成分对照品i的峰面积和浓度[15-18]。

依次进样分析各浓度的混合对照品溶液3 μL，测得各成分色谱峰峰面积。以芍药苷为内参物，计算芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸的相对校正因子，结果分别为0.072、0.336、0.124、0.108、0.872、0.175，RSD值分别为0.35%、1.28%、1.16%、0.17%、0.25%、0.14%。

2.5相对校正因子和相对保留时间的考察采用Waters Aquity UPLC和Agilent 1290 Infinity两个品牌的超高效液相色谱仪及CORTECS UPLC C18和ACQUITY UPLC BEH C18两种色谱柱测定RCF和相对保留时间（RRT）。取“2.2”项下混合对照品溶液，用甲醇稀释得7个浓度的混合对照品溶液，进样3 μL，测定芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸的峰面积。以芍药苷为内参物计算芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸RCF值和RRT值，结果见表3和表4。结果表明使用不同超高效液相色谱仪和不同色谱柱，各成分相对于芍药苷的RCF值和RRT值的RSD均小于5%，说明该方法重现性较好。

2.6外标法与一测多评法测定结果的比较取10批胃力康颗粒，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取各供试品溶液3 μL，进样测定。采用外标法和一测多评法计算样品中芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、甘草酸的含量，结果见表5。结果表明一测多评法与外标法测得的各批次胃力康颗粒样品中7种成分含量的结果相对偏差＜2%，两种测定方法所得结果无明显差异，一测多评法可用于胃力康颗粒的质量控制。

表3　胃力康颗粒中6种主要成分的RCFTab.3 RCFs of six components in Weilikang granules

表4　胃力康颗粒中6种主要成分的RRTTab.4 RRT of six components in Weilikang granules

表5　一测多评法与外标法测定胃力康颗粒中主要成分含量的结果比较Tab.5 Contents of components by external standard method and quantitative analysis of multi-components by single marker mg/g

3　讨论

实验结果表明，采用甲醇-水体系时，胃力康颗粒中各个成分分离度较差，加入甲酸后各色谱峰分离度明显改善，且甲醇-0.1%甲酸水体系分离效果最好。并考察了乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，发现流动相中的有机相选用甲醇的分离效果比乙腈好。最终采用甲醇-0.1%甲酸水作为实验的流动相。在方法建立过程中，分别考察了采用HPLC、UPLC建立检测胃力康颗粒中7种主要成分的分析方法。结果表明，HPLC所需检测时间较长（120 min），而UPLC仅需24 min即可完成检测，极大的提高了检测效率。本研究以芍药苷为内参物，建立了能同时测定胃立康颗粒中芍药苷、芦丁、柚皮苷、迷迭香酸、丹酚酸B、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和甘草酸7种有效成分的一测多评法，与现有检测方法比较[19-20]，能够更加快速、全面、准确的控制胃力康颗粒的药品质量。

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（本文编辑：高杉，马英）

Simultaneous determination of seven constituents in Wenlikang granules by quantitative analysis of multi-components by single marker

CHAI Shi-wei1，2，TU Ya-ru1，WANG Xing-rui1，LIU Er-wei1，CHANG Yan-xu1，HE Jun1，3
（1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 2. The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China; 3. Tianjin State Key Laboratory of Modern Chinese Medicine-Province and Ministry Co-established State Key Laboratory Cultivation Base, Tianjin 300193, China）

Abstract:[Objective] To establish a method for simultaneous determination of seven bioactive components in Weilikang Granules by quantitative analysis of multi-components by single marker（QAMS）. [Methods] Peoniflorin was select as an index，relative correction factors of Rutin，Naringin，Rosmarinic acid，Salvianolic acid B，Emodin-8-O-β-D-glucopyranoside and Glycyrrhizic acid were established by UPLC and calculated to achieve QAMS. The accuracy of the new method was evaluated by comparing the results between QAMS and the external standard method. [Results] The analysis method was established and there is no significant difference between the calculated contents and the contents which were determined by external reference method in 10 batches of samples. [Conclusion] The QAMS method is reliable，accurate to control the quality of seven bioactive components of Weilikang granules.

Key words:Weilikang granules；quantitative analysi of multi-components by single marker；UPLC；quality control

收稿日期：（2015-11-30）

通讯作者：何俊，E-mail：hejun673@163.com。

作者简介：柴士伟（1979-），男，博士研究生，主管药师，主要从事中药分析研究工作。

*基金项目：国家科技重大专项重大新药创制项目（2013ZX0 9402201）。

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.04.14

中图分类号：R927.2

文献标志码：A

文章编号：1672-1519（2016）04-0241-04