旋覆代赭汤及其拆方对RE大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响*

苗嘉萌，杨幼新，马　艳，许云姣，邓艳蓉，戚经天，袁红霞

（天津中医药大学，天津　300193）



旋覆代赭汤及其拆方对RE大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响*

苗嘉萌，杨幼新，马艳，许云姣，邓艳蓉，戚经天，袁红霞

（天津中医药大学，天津300193）

摘要：[目的]探讨反流性食管炎（RE）食管黏膜血浆细胞能量代谢与黏膜损伤的关系以及旋覆代赭汤治疗RE的作用机制。[方法]将120只Wistar大鼠按照随机数字法随机分为10组，每组12只，即正常组、模型组、旋覆代赭汤全方组（全方组）、苦降组、甘升组、升降相因组、去苦降组、去甘升组、去升降相因组和西药组；除正常组外，其余9组行“4.2 mm幽门夹+胃底2/3结扎术”造模。治疗14 d后，即造模后第22天处死，检测各组大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶的活性。[结果]实验后各模型组大鼠ATP酶活性低于正常组；全方组、西药组酶活性较好，与正常组差异无统计学意义（P＞0.05），与模型组相比有统计学差异（P＜0.05）；苦降组及去甘升组与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），与全方组及西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；正常组与其他各组比较，均有统计学差异（P＜0.05）；西药组与全方组比较，差异无统计学意义。[结论]旋覆代赭汤全方组能提高模型大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶的活性，改善模型大鼠食管黏膜组织形态学病变，且作用优于各拆方组。

关键词：反流性食管炎；旋覆代赭汤；气机升降；血浆Na+-K+-ATP酶及Ca(2+)-Mg(2+)-ATP酶

反流性食管炎（RE）是指胃、十二指肠内容物反流入食管而引起食管黏膜损伤的一种慢性难治性疾病[1]。现代医学主要以抑酸、促胃肠动力等药物治疗RE，但并不能从根本上解决反流问题，且具有复发率高、不良反应大、医疗费高等弊端[2-3]。因此，寻找治疗RE有效、合理的方案，一直是医学界探索的热点和难点。课题组多年来运用气机升降理论[4]，谨守胃虚气逆这一病机，应用经典名方旋覆代赭汤治疗RE[5]，取得了良好的临床疗效[6-7]。为了探求其作用机制，本实验比较了旋覆代赭汤及其拆方对大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶酶活性的差异。

1　实验材料及方法

1.1材料

1.1.1实验动物健康雄性Wistar大鼠120只，体质量（200±20）g，由军事医学科学院放射医学研究所提供，合格证书编号：MA-2014-111，饲养于Ⅱ级动物饲养室。

1.1.2实验药物1）全方组：旋覆花15g，代赭石5g，清半夏10 g，生姜25 g，人参10 g，炙甘草15 g，大枣15 g。2）拆方组各组：苦降组由旋覆花15 g，代赭石5 g组成；甘升组由人参10 g，炙甘草15 g，大枣15 g组成；升降相因组由清半夏10 g，生姜25 g组成；全方去苦降组由清半夏10 g，生姜25 g，人参10 g，炙甘草15 g，大枣15 g组成；全方去甘升组由旋覆花15 g，代赭石5 g，清半夏10 g，生姜25 g组成；全方去升降相因组由旋覆花15 g，代赭石5 g，人参10 g，炙甘草15 g，大枣15 g组成。3）中药全部选用颗粒剂，由北京康仁堂药业有限公司提供，将按照规定剂量的中药颗粒剂倒入容器内，加热水（水温为80～100℃）充分搅拌，调制成9.6 g/mL溶液。4）西药组用药为枸橼酸莫沙比利片（鲁南贝特制药有限公司）与兰索拉唑肠溶片（汕头市经济特区铊滨制药厂），按照药品说明书用量，研成极细粉末，配制成浓度为0.15 g/L的混悬液后装瓶。5）上述药物均置4℃冰箱备用。

1.1.3实验试剂病理包埋、染色等所需基本试剂由天津市中西医结合急腹症研究所提供；生理盐水、0.5%碘伏、注射用左氧氟沙星由扬子江药业集团有限公司提供；10%水合氯醛、10%甲醛溶液，苏木精-伊红染色液由天津市化工二厂提供；考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，超微量ATP酶测试盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.1.4实验器材手术剪、尖头组织镊、动脉夹、3/0带针缝线、6/0带针缝合线、持针器、注射器等常规手术器械（上海医疗器械厂）；直径4.2 mm圆柱形钢条、直径3.0 mm的双扁铁心包扎线（夹心金属直径0.3 mm）；NOVEL光学显微镜，型号为XS2-106B （N）；日立透射电子显微镜，型号H7650（中国科学院天津工业生物技术研究所提供）；莱卡超薄切片机，型号EMUC6；防脱氨基载玻片；精密电子天平，型号AE16O型；Heraeus台式高速离心机，型号PLCO型；低温离心机，型号5810R型；722光栅分光光度计，型号96306J031；恒温水浴箱，型号DZW-4型。

1.2方法

1.2.1分组将120只Wistar大鼠常规饲养7 d，按照随机数字法随机分为10组，每组12只，即正常组、模型组、旋覆代赭汤全方组及拆方各组、西药组，共计10组，每组12只。

1.2.2造模手术严格按照无菌操作要求，造模组大鼠于术前24 h禁食不禁水，采用“4.2 mm幽门夹+胃底2/3结扎术”法造模[8]；正常对照组行假手术。各组术后24 h禁食不禁水，术后3 d，每日腹腔内注入盐酸左氧氟沙星注射液1.5 mg/kg，预防感染。此后常规喂养。

1.2.3药物干预正常组：于造模7 d后，予生理盐水按10 mL/kg体质量灌胃，每日2次，与治疗组同日处死。模型组：同正常组。各治疗组：即旋覆代赭汤全方组、拆方各组及西药组，共计8组，于造模术后7 d开始，予相应药液按照10 mL/kg体质量灌胃，每日2次，经治疗14 d后，即造模后第22天处死各组动物进行指标检测。

1.2.4处死及取材各组动物处死前24 h，禁食不禁水，麻醉后，迅速开腹，胃—食管交界上0.5 cm处向咽喉部截取1.5～2.0 cm长的食管组织，用冰生理盐水清洗，然后将取下的食管组织，浸泡于10%福尔马林中，常规制备病理切片。同时迅速从腹主动脉取血2 mL，置于含有10%EDTA二钠60 μL的离心管中混匀，4℃离心（3 000 r/min，15 min），取血浆后分装，放入-70℃冰箱保存备检。

2　指标观察与检测

2.1指标观察记录每日大鼠的死亡数、死亡率、死亡原因、皮毛、饮水变化量、精神状态及活动情况、体质量等[9]。

2.2指标检测

2.2.1食管黏膜组织肉眼及病理形态学观察肉眼观察食管上皮组织并进行RE分级，将病理切片行HE染色并通过光镜观察，对其进行RE病理分级[10]。

2.2.2血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的检测测定原理：ATP酶可分解成ADP及无机磷，测定无机磷的量可判断ATP酶活力的高低。规定每小时1 mg血浆组织蛋白的ATP酶分解ATP产生1 μmoL无机磷的量为1个ATP酶活力单位。具体测定过程、计算方法及注意事项严格按照测试盒说明说执行。

2.3统计学方法使用SPSS 18.0统计软件处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较若方差齐采用LDS法，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunne’t T3；P＜0.05差异有统计学意义。

3　实验结果

3.1一般情况造模术后22 d，大鼠共死亡19只，各组具体死亡情况（详见表1）。实验前各组大鼠体质量差异无统计学意义，实验后各模型组大鼠体质量明显低于实验前，与正常对照组比较也明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；灌胃后14 d后，全方组、西药组恢复最好，与模型组相比有统计学差异（P＜0.05）；苦降组及去甘升组与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），与全方组及西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；正常组与其他各组比较，均有统计学差异（P＜0.05）；西药组与全方组比较，差异无统计学意义，见表2。

表1　造模后22 d各组大鼠死亡情况及原因分析Tab.1 Analysis of rats death condition and reason after molding 22 days of each group只

3.2食管黏膜肉眼观察表现积分及镜下病理改变模型组与正常组比较肉眼表现积分及镜下病理积分差异具有统计学意义（P＜0.01）；全方组、西药组较模型组肉眼积分和病理积分差异有统计学意义（P＜0.05），甘升组、升降相因组二组之间肉眼积分无统计学差异，但与其他各组比较均有统计学差异（P＜0.05），而甘升组、升降相因组两组之间病理积分无统计学差异，但与其他各组比较均有统计学差异（P＜0.05）；苦降组与全方组相较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表3、表4）。

表2　治疗前后各组大鼠体质量变化情况统计（±s）Tab.2 The rats body weight change statistics of rats before and after treatment of each group（±s）

组别　实验前体质量（g）实验后体质量（g）体质量变化（g）正常组　219.8±8.4　 246.6±14.2　 26.8±4.4模型组　219.9±8.7　 163.0±8.5　 -56.8±4.6西药组　218.4±9.2　 205.8±10.1　 -12.7±5.7全方组　219.2±10.5　 209.6±6.4　 -9.7±4.5甘升组　220.1±9.2　 184.5±8.9　 -35.6±5.6苦降组　219.3±8.0　 163.8±10.5　 -55.4±6.3升降相因组　218.3±7.6　 183.4±8.7　 -34.8±5.1去甘升组　219.2±1.6　 164.8±9.5　 -55.4±7.9去苦降组　220.1±10.1　 184.4±8.6　 -35.7±1.5去升降相因组　218.3±8.9　 182.4±8.9　 -35.9±0

表3　各组大鼠食管黏膜肉眼分级及积分（±s）Tab.3 The esophageal mucosa naked eye grading and integral in rats of each group（±s）

组别　　动物数　　肉眼分级（只）　　积分（分）0级Ⅰa级Ⅰb级Ⅱ级Ⅲ级正常组　10　 9　 1　 0　 0　 0　 0.10±0.30模型组　7　 0　 0　 1　 4　 2　 2.21±0.57西药组　9　 4　 2　 2　 1　 0　 0.78±0.79全方组　9　 4　 2　 3　 0　 0　 0.72±0.71甘升组　8　 0　 3　 5　 0　 0　 1.31±0.26苦降组　7　 0　 2　 4　 1　 0　 1.53±0.35升降相因组　8　 0　 1　 5　 2　 0　 1.33±0.32去苦降组　8　 1　 2　 4　 1　 0　 1.25±0.59去甘升组　7　 0　 1　 0　 5　 1　 2.00±0.58去升降相因组　8　 0　 2　 5　 1　 0　 1.58±0.32

3.3血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的测定实验后各模型组大鼠酶活性低于正常对照组；灌胃后14 d后，全方组、西药组酶活性最好，与正常组差异不明显，与模型组相比有统计学差异（P＜0.05）；苦降组及去甘升组与模型组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），与全方组及西药组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；正常组与其他各组比较，均有统计学差异（P＜0.05）；西药组与全方组比较，差异无统计学意义，见表5。

表4　各组大鼠食管黏膜病理分级及积分（±s）Tab.4 The esophageal mucosa pathological grading and integral of rats in each group（±s）

表4　各组大鼠食管黏膜病理分级及积分（±s）Tab.4 The esophageal mucosa pathological grading and integral of rats in each group（±s）

组别　　动物数　　病理分级（只）　　积分（分）正常　轻度　中度　重度正常组　10　 10　 0　 0　 0　 0.00±0.00模型组　7　 0　 0　 1　 6　 2.86±0.38西药组　9　 5　 4　 0　 0　 0.67±0.50全方组　9　 4　 5　 0　 0　 0.56±0.53甘升组　8　 1　 2　 5　 0　 1.50±0.76苦降组　7　 0　 0　 2　 5　 2.71±0.49升降相因组　8　 1　 0　 7　 0　 1.65±0.71去苦降组　8　 2　 1　 5　 0　 1.38±0.92去甘升组　7　 0　 2　 5　 0　 2.57±0.53去升降相因组　8　 1　 1　 6　 0　 1.63±0.74

表5　实验后各组大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性表（±s）Tab.5 Table of plasma Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP enzymes of rats after the experiment in each group（±s）

表5　实验后各组大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性表（±s）Tab.5 Table of plasma Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP enzymes of rats after the experiment in each group（±s）

Ca2+-Mg2+-ATP酶活性[μmol/（mg·h）]正常组　10　0.625±1.112　0.712±0.967模型组　7　0.247±0.747　0.341±0.944西药组　9　0.550±1.09　0.652±1.112全方组　9　0.534±0.981　0.621±1.098甘升组　8　0.519±1.64　0.628±1.342苦降组　7　0.254±0.094　0.356±1.094升降相因组　8　0.504±1.76　0.612±1.661去苦降组　8　0.328±1.32　0.423±1.321去甘升组　7　0.330±0.770　0.420±1.170去升降相因组　8　0.354±1.67　0.414±1.067组别　　动物数Na+-K+-ATP酶活性[μmol/（mg·h）]

4　讨论

现代医学认为，食管下括约肌（LES）压力降低及一过性松弛为RE发病的主要机制之一。LES压力主要来源于平滑肌的舒缩功能，ATP酶是哺乳动物能量转换及代谢的主要介质。ATP酶是能量产生的催化剂，能量代谢异常可影响肌肉的正常收缩功能[11-12]。Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶不仅为细胞维持正常形态和功能提供了条件，而且建立了一种势能贮备，为平滑肌收缩提供了动力。本实验通过手术的方法制备酸碱混合反流型RE大鼠模型，运用拆方法研究观察旋覆代赭汤及其拆方对于RE模型大鼠一般情况、食管病理形态、血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性的影响，从而讨论脾胃气机升降和线粒体能量代谢之间的密切联系，从能量代谢的角度阐释RE的发病机制。血浆细胞中Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显降低时，细胞外Na+、Ca2+进入膜内，两者竞争性抑制，由于渗透压的关系，水分子进入胞膜内，引起细胞肿胀，破坏细胞结构，最终导致血液循环不畅，这可能是引起或加重食管黏膜组织水肿主要原因。

通过对比各相关指标，发现全方组优于其他拆方组，其中苦降组大鼠生活质量、病理程度、酶活性最差，与模型组相比无差异。由此可以推断，旋覆代赭汤全方能够明显提高RE大鼠血浆Na+-K+-ATP酶及Ca2+-Mg2+-ATP酶的活性，从而确保食管上皮细胞营养物质的吸收前提条件，从而保证食管黏膜细胞完整性，或修复已受损的食管黏膜细胞。而苦降组验证了课题组对于RE主要病机的论述，即胃虚气逆。苦降组用药寒凉，苦寒伤正，只降不升，本虚亦甚，气机壅滞，故不能起到治疗之功。综上所述，旋覆代赭汤全方具有益气健脾，降逆化痰的功效，可调节脾胃气机，扶中降逆，攻补兼施，标本同治，从而达到治疗RE的目的。本研究从科学角度探讨了线粒体能量代谢与旋覆代赭汤作用机制的相关性，不但进一步验证了RE的关键病机是“胃虚气逆”，从而为旋覆代赭汤是否通过调节脾胃气机升降，从而调节线粒体能量代谢，改善LES舒缩功能，来治疗RE提供了有力依据。

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（本文编辑：马英，于春泉）

Effects of Xuanfu Daizhe decoction on Na+-K+-ATP and Ca2+-Mg2+-ATP enzymes activity of plasma in reflux esophagitis rats

MIAO Jia-meng，YANG You-xin，MA Yan，XU Yun-jiao，DENG Yan-rong，QI Jing-tian，YUAN Hong-xia，
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

Abstract:[Objective] Expolration on the esophageal mucosa cell energy metabolism dysfunction and mucosal damage and function mechanism of Inula Daizhe decoction in treating reflux esophagitis（RE）. [Methods] The 120 Wistar rats were randomly divided into 10 groups，with 12 rats in each group and normal control group，model control group，Inula Daizhe decoction group Quanfang group，Kujiang group，Gansheng group，Shengjiang Xiangyin group，Quanfang subtraction Kujiang group，Quanfang subtraction Gansheng group，Quanfang subtraction Shengjiang Xiangyin group and Western medicine group；in addition to the normal control group（normal group），the other 9 groups molding by“4.2 mm pylorus clamp+gastric bottom two-thirds ligation”，after treatment of 14 days，the rats were sacrificed，and the activity of Na+-K+-ATP and Ca(2+)-Mg(2+)-ATP in plasma was detected. [Results] After the experiment ATP enzyme activity in the model group rats lower than normal control group；enzymes activity in Quanfang group and Western medicine group was best，compared with normal group，and the difference was not obvious，compared with model group the difference was significant（P＜0.05）；compared with Kujiang group and Quanfang subtraction Gansheng group with model group，the difference was not statistically significant（P＞0.05）. Compared with Quanfang group and Western medicine group，it was statistical significance（P＜0.05）. Compared the normal group with the other groups，the differences were statistically significant（P＜0.05）；compared Western medicine group with Quanfang group，the difference was no statistically significant. [Conclusion] Xuanfu Daizhe decoction Quanfang group can improve plasma Na+-K+-ATPase and Ca(2+)-Mg(2+)-ATPase activity in the model rat，improve the model of rat esophageal mucosa tissue morphologic changes and the effect is better than that of the demolition party group.

Key words:reflux esophagitis；Xuanfu Daizhe decoction；ascending and descending of Qi；Na+-K+-ATPase and Ca(2+)-Mg(2+)-ATPase

收稿日期：（2015-12-25）

作者简介：苗嘉萌（1990-），男，硕士，研究方向为全科医学。通讯作者：杨幼新，E-mail：youxin _ yang@hotmail.com。

*基金项目：国家自然科学基金项目（81173243）。

DOI：10.11656/j.issn.1672-1519.2016.04.11

中图分类号：R256.31

文献标志码：A

文章编号：1672-1519（2016）04-0231-04