饲料发酵对猪粪厌氧堆肥发酵过程中酶活的影响

盛清凯 夏冬 孟宪利 韩红 赵红波 李祥明

摘 要：为促进种养结合，研究饲料发酵对猪粪堆肥厌氧发酵的影响。试验分为三组，对照组为饲喂干粉料的母猪粪，试验Ⅰ组为干粉料母猪粪+混合菌（枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌），试验Ⅱ组为饲喂混合菌厌氧发酵饲料的母猪粪。不同猪粪分别与小麦壳混匀后堆积厌氧发酵。结果表明：饲料发酵使饲料和新鲜猪粪中乳酸菌增加，大肠杆菌减少（P<0.01），纤维素酶活性增加（P<0.05）；堆肥过程中，试验Ⅰ组和Ⅱ组纤维素酶、蛋白酶、脲酶的活性先降低然后逐渐升高，两组变化趋势相似（P<0.05）。饲料发酵影响堆肥中酶的活性，发酵饲料猪粪容易腐熟，枯草芽孢杆菌可能在生猪饲料发酵及堆肥发酵整个过程中发挥作用。

关键词：发酵饲料；猪粪；堆肥；纤维素酶；枯草芽孢杆菌

中图分类号：S816.6文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）05-0111-05

Abstract To promote the combination of cropping and livestock farming， the effects of feed fermentation on enzyme activities in pig feces during anaerobic composting fermentation were investigated. The test contained three groups， the control group was feces of sows fed with dry mash， the group Ⅰ was feces added mixed bacteria （Bacillus subtilis and Lactobacillus plantarum）， and the group Ⅱ was feces of sows fed with wet diet anaerobically fermented by mixed bacteria. The feces were respectively anaerobically fermented after mixed with wheat shells. The results showed that feed fermentation increased the lactic acid bacteria contents in feed and fresh feces， while the E. coli contents decreased （P<0.01）， and the cellulase activity increased （P<0.05）. The variation trends of cellulase， protease and urease in group Ⅰ and Ⅱ were similar during the composting process （P<0.05）. The results indicated that feed fermentation affected the enzyme activities in composting， the feces of fermented feed was easy to compost and Bacillus subtilis might play a key role in the whole process of feed fermentation and composting fermentation.

Key words Feed fermentation； Pig feces； Composting； Cellulase； Bacillus subtilis

畜禽养殖业的发展在提高人们生活水平的同时所带来的养殖污染也日益引起人们的重视。畜禽粪便作为动物的排泄物，其组分及含量受饲料中蛋白质含量及益生菌的影响[1～3]。同时畜禽粪便含有作物生长所需的氮磷钾等多种营养元素和有机质，又是重要的有机肥资源，其变化还影响着粪肥等后续产品的加工及质量[4]。堆肥是常用的一种处理粪便的方法，通过堆肥可实现畜禽粪便无害化和有机肥生产的统一，是养殖业和种植业的对接技术之一。从饲料生产这一源头开始研究饲料对粪便堆肥的影响有助于养殖、种植业的结合。

饲料中添加外源菌厌氧发酵后，有益菌扩繁，淀粉酶、蛋白酶等酶活升高，猪生产性能提高，猪粪中的菌群发生变化，粪便中氮磷被降解及减排，臭味降低[5，6]。饲料发酵对粪便堆肥的影响尚不清楚。由于饲料发酵及堆肥发酵都是在微生物作用下完成的，饲料发酵中的微生物可能通过微生物自身或微生物分泌的酶制剂等产物影响着体外猪粪的堆积发酵。酶作为微生物分泌的产物，分解猪粪中的纤维素、蛋白质等物质，其活性可作为判定猪粪堆制过程中腐熟程度的定量生化指标[7]。本研究就发酵饲料对猪粪堆肥发酵中酶活的影响进行探析，以期为养殖污染治理及粪便的资源化利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物和材料

体况相近、产仔数相近、产3胎的大×长二元健康、妊娠1天的母猪120头，由临邑绿叶种猪场提供。枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌皆由山东省农业科学院畜牧兽医研究所提供，其含量均为1×109 cfu/g，添加剂量为0.05%。小麦壳由市场购买。

1.2 试验设计

将母猪随机均分为对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组，单栏饲养。对照组和试验Ⅰ组母猪饲喂母猪干粉状全价配合饲料，试验Ⅱ组饲喂以母猪干粉状全价配合饲料为基础的发酵湿料。发酵湿料制作方法为将母猪干粉状全价配合饲料与枯草芽孢杆菌和乳酸菌混合后塑料袋厌氧发酵[8]。发酵成熟后开始饲喂。生猪由专人饲喂，干清粪法分别收集不同组的新鲜粪便，将其各自与小麦壳按1∶1体积比混匀后装入直径为1.0 m、高度为1.5 m的避光密封塑料桶中厌氧发酵。每组3个桶。试验Ⅰ组小麦壳中添加枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌，添加剂量为0.05%，对照组和试验Ⅱ组的小麦壳中不添加枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌。

1.3 取样

生猪饲喂1个月后在10处代表性位点收集对照组和试验Ⅱ组饲料样品（n=10），进行细菌和酶活指标检测。同期对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组每组随机选取10头早7∶00空腹收集生猪新鲜粪便（n=10），其中对照组和试验Ⅰ组进行菌群、pH及酶活等相关指标检测。然后将三组新鲜猪粪分别与小麦壳混匀填入塑料桶进行厌氧发酵，厌氧发酵时每桶选取代表性位点4处每隔3天测定一次表面20 cm深处的发酵温度（n=12），每隔6天每桶中选取4处代表性位点取样对发酵猪粪的发酵温度、酶活进行分析（n=12）。

1.4 检测指标及方法

饲料和粪便及堆肥中酶活性的测定：将样品与水按重量比1∶6比例稀释，0.45 μm过滤，取滤液按照试剂盒说明进行测定。纤维素酶、中性蛋白酶、脲酶及过氧化氢酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。同时取滤液测定pH值。

乳酸菌、大肠杆菌采用平板计数法计数。

1.5 数据处理

采用SAS （ V 9.1） 软件对所有数据进行处理，饲料和猪粪中的数据采用t-test进行t检验，厌氧发酵过程中的数据采用ON-WAY ANNOVA进行方差分析，用Student-Newmnan-Keuls法进行多重比较，P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著。不同酶活的相关性采用CORR程序分析。数据结果用平均数±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 饲料发酵对饲料和新鲜猪粪菌群及酶活的影响

由表1可见，和对照组相比，试验Ⅱ组饲料中的乳酸杆菌含量、纤维素酶酶活极显著升高（P<0.01），中性蛋白酶和脲酶的活性显著升高（P<0.05），大肠杆菌含量极显著降低（P<0.01）。试验Ⅱ组猪粪中的乳酸杆菌含量极显著增加（P<0.01），纤维素酶活性显著增加（P<0.05），大肠杆菌含量极显著降低（P<0.01），中性蛋白酶及脲酶无显著变化（P>0.05）。结果表明，饲料发酵改变了饲料中的微生物菌群及酶活性，并且影响猪粪中的菌群及酶活。

2.2 饲料发酵对饲料和猪粪以及厌氧发酵猪粪pH值的影响

由表2可见，和对照组相比，试验Ⅱ组饲料pH值显著降低，新鲜猪粪pH值显著升高（P<0.05）。在猪粪厌氧发酵的第6、18、30天试验Ⅰ组和试验Ⅱ组pH值显著高于对照组（P<0.05），两试验组之间无显著差异（P>0.05）。结果表明，饲料发酵影响饲料和新鲜猪粪以及厌氧发酵猪粪的pH值。

2.3 饲料发酵对厌氧发酵猪粪发酵温度的影响

由图1可见，随着发酵时间的延长，三组猪粪的发酵温度逐渐升高，维持一段时间高峰，后逐渐降低。高峰期及试验结束时试验Ⅱ组的发酵温度显著高于试验Ⅰ组，试验Ⅰ组显著高于对照组（P<0.05）。结果表明，饲料发酵的猪粪和添加外源菌的猪粪易于发酵。

2.4 饲料发酵对厌氧发酵猪粪酶活的影响

随着发酵的进行，试验Ⅱ组和试验Ⅰ组猪粪中纤维素酶酶活变化趋势相似，皆是6天后逐渐降低，然后略微升高再降低；而对照组则是先升高，维持一定高峰期，然后降低（图2）。中性蛋白酶酶活的变化（图3）与纤维素酶相似。试验Ⅱ组和试验Ⅰ组猪粪中脲酶皆是逐渐降低，发酵24天后略有升高。对照组则是先升高再降低再升高再降低（图4）。对照组过氧化氢酶酶活逐渐降低，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组过氧化氢酶酶活第18天前逐渐降低，而后逐渐升高。第6天试验Ⅰ组酶活极显著高于试验Ⅱ组（P<0.01），显著高于对照组（P<0.05）。第24、30天试验Ⅰ组与试验Ⅱ组无显著差异（图5）。结果表明，饲料发酵和猪粪中添加外源菌影响厌氧发酵猪粪中纤维素酶、蛋白酶、脲酶和过氧化氢酶的活性。

2.5 不同处理猪粪中酶的相关性

试验Ⅰ组和Ⅱ组两组中纤维素酶、中性蛋白酶、脲酶及过氧化氢酶达到显著或极显著相关。表明，发酵饲料猪粪和添加外源菌猪粪在堆肥发酵过程中两组酶的变化趋势相似。

3 结论与讨论

为了提高猪粪堆肥发酵的效果，堆肥发酵前常常添加外源菌。本试验中发酵饲料的猪粪与添加外源菌的猪粪发酵过程中酶活变化类似，表明发酵饲料的猪粪容易堆肥发酵，发酵饲料的猪粪在堆积厌氧发酵时可以不必再添加外源菌，有机肥的生产受饲料发酵影响。

饲料发酵后，发酵饲料和发酵饲料猪粪中的菌群发生改变，影响后续的堆肥发酵。饲料厌氧发酵后，乳酸菌增加，大肠杆菌降低，饲料中的菌群发生变化，这与杨学海等[9]结果相似。枯草芽孢杆菌分泌纤维素酶[10]、蛋白酶、淀粉酶[11]等，导致发酵饲料中纤维素酶、蛋白酶活性升高。植物乳杆菌作为一种乳酸菌，分泌乳酸、降低饲料pH值。枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌共同影响饲料中的菌群。发酵饲料猪粪中菌群改变的原因可能基于以下几个方面，其一，发酵饲料中枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的影响。由于枯草芽孢杆菌为兼性厌氧菌，植物乳杆菌为厌氧菌，在肠道厌氧环境中可以发挥益生菌的功能，导致肠道菌群改变[12]。其二，发酵饲料中有机酸的影响。植物乳杆菌分泌的乳酸以及饲料碳水化合物降解产生的乳酸等酸化剂，可以增加肠道中乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的含量[13]。其三，发酵饲料中的纤维素酶、蛋白酶等酶制剂的影响。饲料中添加纤维素酶等复合酶制剂，可以减少粪氮的含量，促进猪的消化，可能间接影响肠道或粪便中的菌群[14]。粪便中菌群的变化，导致发酵饲料的猪粪易于发酵，这与牛粪、猪粪因粪便菌群不同导致厌氧发酵效果差异的报道类似[15]。

本试验堆肥过程中随温度的变化，不同种类的酶活发生了不同变化，这与古洁[16]的报道相似。酶活变化的原因可能主要与外源枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌有关。枯草芽孢杆菌能形成芽孢，抗逆性强，耐高温及酸碱，在饲料发酵过程中分泌纤维素酶、蛋白酶等酶制剂，经过动物胃肠道的厌氧环境，仍然可以在堆肥过程中发挥作用[17]。盛清凯等[18]在饲料中添加枯草芽孢杆菌后不但降低了猪粪中大肠杆菌的含量，而且降低猪粪体外发酵液中臭气的浓度。植物乳杆菌作为一种乳酸菌，最适生长温度为30～35℃，不耐高温，分泌谷胱甘肽过氧化物酶、总超氧化物歧化酶等，具有清除自由基的功能[19]。枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌的扩繁，可能导致发酵初期纤维素酶、蛋白酶、过氧化氢酶等酶活性增加。由于枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌的耐热性能差异，植物乳杆菌可能在堆肥发酵初期发挥作用，枯草芽孢杆菌可能在整个堆肥发酵过程中发挥作用，这与接种菌剂不同、堆肥发酵效果不同的研究结果类似[17]。

堆肥过程酶活变化的原因也可能与粪肥腐熟过程中的高温有关。酶作为一种蛋白质，其活性受环境温度影响。不同的酶制剂各有其不同的温度范围。纤维素酶作用的适宜温度一般为26～31℃。发酵初期粪肥发酵温度低，中期发酵温度高，后期发酵温度降低。试验中期发酵饲料猪粪发酵温度高于对照组，高温可能降低了酶活性。徐智等[20]报道，堆肥过程中纤维素酶、蛋白酶等酶的活性受堆肥温度显著影响。酶活性也受环境pH值影响，不同堆肥发酵温度下不同pH值对酶活的影响有待进一步研究。

本试验为室外堆肥发酵，发酵过程中突遇降温天气，这可能降低了发酵第18天时的堆肥温度及影响了堆肥腐熟过程中酶的活性。饲料中枯草芽孢杆菌分泌的不同酶制剂分解蛋白质、纤维素等产物对猪粪中链球菌、氮磷及pH值等的影响也有待深入研究。

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