免疫磁珠捕获—通用引物PCR快速检测食品中致病菌

赵爽

食品加工、生产和运输等环境是产生食品致病微生物污染的主要途径，对人们的健康造成了很大威胁。本文借助各种病菌中抗血清及磁性微珠制作免疫磁珠，对食品中的致病菌进行检测，希望可以提高食品中致病菌的检出率。

材料选择

菌株。上海汉尼公司生产，菌种号为ATCC13706，肠炎沙门氏菌；上海汉尼公司生产，菌种号为ATCC7644，单增李斯特氏菌；上海汉尼公司生产，菌种为ATCC25931，宋氏志贺氏菌；深圳出口入境检验局生产，菌种号为03C0077708VB01稻叶型霍乱弧菌；本实验室分离保存，菌种是CC008，E.coliO157：H7。

试剂选择。上海生工生物工程技术公司生产的透析袋；厦门泰京生物技术有限公司的2xTaq PCR MasterMix与DNAma rker I；lgG，Dynal公司的Dyn-abeads M-280Sheep anti-Rabbit；兰州生物制品研究所选取的H7诊断血清和志贺氏菌属四种混合多价血；本デソカ生研株式会社产品为沙门氏菌A-F群“O”多价诊断血清、单增李斯特氏菌诊断血清和“OI”群霍乱弧菌诊断血清。

引物。核苷酸虚列可以表示成：

5，-AAACTCAAAGGAATTGAC GG-3，5，-GACGGGCGGTGTGTACAA-3。

方法

纯化免疫球蛋白。上述五种菌利用饱和硫酸沉淀法进行纯化。首先使用浓度为50%的硫酸铵纯化，然后再使用30%硫酸铵二次纯化。完成沉淀后，放置在PBS中沉淀，获得纯化IgG，对IgG浓度进行测定，调节浓度，低温储存备用。

制备免疫磁珠。将磁珠放人无菌离心管内，每管100微升，然后加入一定量牛血清蛋白液搅拌，将小管放置在磁架上静置两分钟，移除液体并充分洗涤，使用上述完成的缓冲液悬浮100微升，再计人100微升纯化好的IgG，缓慢振荡30分钟，充分洗涤，用悬浮液悬浮至100微升，放置在4摄氏度下备用。

捕获目的菌。将上述五种免疫磁珠离心管各取一支，在各个管内分别加入1毫升与抗体相对的各种菌液，细菌含量为10³cfu/管，摇晃一小时，充分洗涤后加入管内液体，利用100微升的超纯水对致病菌磁珠悬浮其中。

检测磁珠捕获效率。在羊汤中加入沙门氏菌培养，菌落计数后，将其浓度调整到10⁶fu/mL。取出沙门氏菌血清免疫磁珠各100、200、400微升，同时加入沙门氏菌细菌也充分振荡后进行洗涤，PBS悬浮到100微升后，按倍稀释。取出稀释度100微升的菌落计数，重复试验。将其中稀释最好的菌落作为细菌回收率。该细菌收回列表表示磁珠捕获细菌的回收率，并与空白磁珠进行比对。

提取细菌DNA。取出已经捕获的免疫磁珠，将其分被加入无菌离心管中。同时选取没有抗体的磁珠组作为对照，包被沙门氏菌抗血清且不会吸附致病菌的磁珠作为空白比对，实施沸水浴后，离心取上清，低温保存备用。

建立IMC-UPPCR。选取提取好的核算模板作为PCR反应。PCR反应体系为2×PCR反应液12.5微升，DNA模板10微升，上下游引物各0.5微升。在94摄氏度进行5分钟反应，52摄氏度进行1分钟，72摄氏度进行2分钟，循环进行35次，再在72摄氏度进行5分钟，将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

样本检测。检测样本分被利用IMC-UPPCR方法、GB/T4789.30-2003方法、國标GB/T4789.4-2008等对食品样品进行检测。主要对单增李斯特氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌和0157：H7含量进行检测，验证IMC-UPPCR方法的正确性，重复两次实施检测，对比实验结果，计算符合率。

结果

免疫磁珠捕获效率。沙门氏菌和免疫磁珠反应后，可以对免疫磁珠菌落输进行计算。经过分析发现细菌回收率在80%。不同体积磁珠悬液体无差异，吸附后空白磁珠培养无菌落生长。

IMC-UPPCR。将肠炎沙门氏菌、稻叶型霍乱弧菌、单增李斯特氏菌等加入到抗体免疫磁珠离心管内部，可以发生UPPCR反应，结果具有差异片段，现实阴性对照和空白对照无白条。

特异性反应。将各种包被有血清的免疫磁珠谱或致病菌后，进行PCR反应。结果可显示特异性片段，非对应血清无特异片段出现。

样品检测结果。使用IMC-UPPCR方法完成检测后，可以发现，沙门氏菌和单增李斯特氏菌结果完全一致。大肠杆菌O157：H7均呈阳性；利用国标法检测两种样品呈现阴性。由此可说明，IMC-UPPCR和国标方法结果符合，且比国标方法敏感。

从上述分析可以看出，IMC-UPPCR方法完全可以应用到食品中致病菌的检测中，具有灵敏性高、特异性强和检测时间短暂等特点，保证了检测质量，提升了检测率，可以广泛应用到食品致病菌检测中。