水产品中硝基呋喃类代谢物残留量高效液相色谱串联质谱快速检测法的研究

周道志

硝基呋喃类抗生素主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因，是一类广谱抗生素，被广泛用作饲料添加剂。研究表明，硝基呋哺类药物是一种诱导有机体基因突变的有害物质。近几年来，我国、欧盟（EU）、韩国等在适用动物禁用的兽药中已明令禁用硝基呋哺类药物，检测硝基呋喃类化合物的代谢产物对监控禁药更具有实际意义。

当前国际上普遍采用液相色谱串联质谱法进行硝基呋喃代谢物的检测和确证。水解和衍生化是质谱法检测硝基呋喃代谢物的关键步骤，常用的衍生化试剂是邻硝基苯甲醛，衍生时间长达16h，使硝基呋喃传统的质谱检测方法最快检测周期长达约19小时。本快速检测方法与传统方法相比，改变了酸性水解液的浓度、改变了样品孵育的方式及温度，将样品的孵育温度由37℃直接提高至60℃且使用水浴孵育提高样品孵育的效率。在酸性条件下使硝基呋哺代谢物与蛋白质水解，同时用邻硝基苯甲醛衍生化，研究对比发现使用水浴60℃水浴孵育衍生0.5h时，不仅能够大幅缩短反应时间，而且可以达到传统质谱检测方法的灵敏度，且方法的重现性好，精密度高，最快的检测周期由传统质谱检测方法的19小时缩短至3.5小时，实现了使用质谱仪对水产品中硝基呋喃代谢物的快速检测。

方法原理

样品经0.2MHCl提取，样品中的AOZ、SEM、AHD、AMOZ残留物与衍生化试剂2-硝基苯甲醛（NBA）反应，分别生成NP-AOZ、NP-SEM、NP-AHD、NP-AMOZ，衍生物经乙酸乙酯萃取，萃取液用氮气流挥干，残渣用纯净水溶解后用正己烷脱脂，用液相色谱一质谱/质谱仪测定，外标法峰面积定量。

检测流程

样品制备（水产品取可食部分）——样品恒温孵育提取（水解液浓度0.2M盐酸、水浴、60℃）——样品净化——样品测定。

具体检测步骤

试样制备。

虾去壳取虾肉，鱼去皮去骨头取肌肉，用组织粉碎机匀质。装入洁净容器内，密封，标记，于-18℃保存，每份样品量不少于100g。

分析步骤。

（1）提取步骤。称取经肉类组织粉碎机粉碎的试样2g（精确至0.01g）于50mL离心管中，加入10mL0.2Mol/L盐酸溶液在匀浆机上以16000r/min速度匀浆15秒，用5mL0.2Mol/L盐酸溶液洗涤匀浆刀，合并提取液。

（2）样品恒温孵育提取。离心管中加入4001JL]00mMol/L新配制的2-硝基苯甲醛（NBA）衍生试剂振荡]分钟；放在60℃恒温水浴锅中反应0.5小时。孵育过程要注意避光操作。

（3）净化方法。离心管在4500r/min下离心10min，上清液转入另一离心管中，残渣弃去。上清液中加入5mL0.1Mol/LKH₂PO₄溶液，用1Mol/LKOH溶液调节pH值在7～7.5范围。离心管中加入10mL乙酸乙酯，在振荡器上震荡5分钟，以4500r/min速度离心10min，吸取5mL上层清液（相当于1g样品）移至吹氮浓缩仪的吹氮管中，在50℃下用氮气将试管内的溶剂挥干，残渣用1mL纯净水溶解，漩涡振荡器上混漩60秒，加入3mL正己烷，漩涡振荡器上混漩60秒，在4500r/min下离心10min后，样液经0.22μm滤膜过滤后上机测定。

仪器参数与测定。

（1）色谱测定条件。色谱柱：菲罗门C₁₈，150mm×2.0mm（id），粒度5μm，luna；流动相：乙腈+0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱模式。

（2）质谱条件。离子源ESI，正模式，多反应选择离子监测方式（MRM）。

结果与分析

样品衍生条件的优化。4种硝基呋喃的分子量在75～201，在这个质量范围内质谱背景噪音很大，4种代谢产物的电离效率比较低，因此它们的质谱检测灵敏度低。而在酸性条件下，利用邻硝基苯甲醛上的醛基（-CHO）可以与AMOZ、SEM、AHD、AOZ等4种代谢物上的含氮亲核基团胺基（-NH）发生醛胺亲核加成反应，可以分别形成较好的特性衍生物，使衍生物的分子离子质荷比大于200，处于相对适于检测的质量区域，质谱检测灵敏度会有很大提高。在实验室多年的硝基呋喃类检测的经验和参考相关资料的基础上，选择采用盐酸水解，邻硝基苯甲醛衍生化。本试验比较了37℃恒温（空气浴）振荡]6h，60℃恒温（空气浴）振荡2h，60℃恒温水浴2h，60℃恒温（空气浴）振荡0.5h，60℃恒温水浴0.5h等5种条件下的衍生效率。研究发现，60℃恒温水浴衍生效率比60℃恒温（空气浴）振荡衍生效率高，60℃恒温水浴2h与0.5h没有显著差异（见表]），均达到标准SN/T1627-2005的要求。本试验60℃恒温水浴0.5h，缩短了反应时间且产率提高，实现了快速检测。本试验中还比较了pH值对衍生效率的影响，研究发现pH值为7.0-7.5时，4种呋喃代谢物衍生物的回收率最高。

快速水解衍生方法的實验回收率及灵敏度。为了确定快速检测方法中4种呋喃代谢物衍生化效率的高低，本实验在空白虾基体中添加4种硝基呋喃代谢物标准溶液，使其浓度水平均为1μg/kg，然后采用上述的5种方式进行衍生化处理，每种方式做6组平行，其实验回收率及灵敏度如下表：

5种衍生化方式处理硝基呋喃样品的实验回收率及灵敏度比较可看出，60℃恒温水浴衍生效率比60℃恒温（空气浴）振荡衍生效率高，60℃恒温水浴2h与0.5h没有显著差异，均达到传统质谱检测方法的效果，即可达到37℃恒温（空气浴）振荡16h衍生的效果。本快速检测方法与传统质谱检测方法同样具有较高的灵敏度、较好的重现性。因此，新方法能够满足实验检测分析的要求。

快速检测方法的准确性。以传统质谱检测方法、行业标准SN/T1627-2005检测获得的3个阳性虾样品，样品1AOZ残留量为0.851μg/kg，样品2AOZ残留量为2.58μg/kg的，样品3SEM残留量为1.23μg/kg。分别按标准SN/T1627-2005及本快速检测方法60℃恒温水浴0.5h衍生反应进行实验处理，每个样品做双平行，结果如下表：

经表2比较，由行业标准方法测定残留量分别为AOZ0.85μg/kg的样品1和AOZ2.58μg/kg的样品2及SEM残留量为1.23μg/kg的样品3，与本快速检测方法重复测定的定量结果较一致，显示了快速检测方法对硝基呋喃检测有较好的重复性和定性可靠性。因此，可看出本快速衍生化方法是可行的，即本硝基呋喃快速检测方法完全能满足硝基呋喃类代谢物残留检测的要求。

通过实验及研究表明，硝基呋喃类代谢物高效液相色谱串联质谱快速检测方法检测水产品中的呋喃唑酮代谢物AOZ、呋喃它酮代谢物AMOZ、呋喃西林代谢物SEM、呋喃妥因代谢物AHD等硝基呋哺类代谢物可行。该方法的准确度、回收率和精密度均较好，真正意义上填补了水产品硝基呋喃类代谢物质谱快速检测领域的空白。