微波辅助复合酶提取锦灯笼皮果胶的工艺优化

张超 王英臣

摘 要：以吉林地区的锦灯笼皮为原料，利用微波辅助复合酶法对锦灯笼皮中果胶进行工艺优化研究。研究了微波辐射时间、加酶比例（m半纤维素：m纤维素）、复合酶用量（m半纤维素：m纤维素=1：1）、微波功率、料液比、酶解温度、pH值、酶解时间对果胶提取的影响。采用Box-Behnken Design 响应面优化得到最佳工艺条件为微波辐射时间3.35min、加酶比例1：1.27、复合酶用量（1：1.27）7.78mg、微波功率399.39w。在此条件下验证果胶得率为9.368%，总半乳糖醛酸为63.02%，通过工艺优化研究可知，实际果胶得率远小于预测果胶得率。

关键词：锦灯笼皮；果胶；提取；响应面分析；微波；复合酶

中图分类号：Q539.8 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20160431002

果胶是一种可溶性纤维，具有许多对人体有益的特性，对人体的健康起一定的作用。果胶是制作人类食品和化妆品的天然成分，同时是食品添加剂联合委员会推荐和公认的安全、天然、新型、功能型食品添加剂。在食品领域中，果胶可以制作果冻，饮料，化妆品等产品。饮食中摄入果胶可促进粪便中脂肪、中性类固醇及胆汁的排泄[1]。

到目前为止，提取果胶的发法有很多，但绝大多数的果胶提取率都很低。酸法提取是目前应用最广泛的，但是对环境污染比较严重。采用酸法提取，果胶提取率低，所以寻求一种环保、高效的提取方法势在必行。目前已有微波辅助法提取果胶的报道，例如微波提取橘皮果胶工艺研究进展[2]，微波辅助提取西番莲果皮中的果胶研究等[3]。本实验采用东北地区的锦灯笼为原料，采用微波辅助复合酶法对锦灯笼皮中果胶的提取进行了优化研究，并采用Box-Behnken Design实验设计对工艺进行了优化研究，通过本次的研究，获得了一种环保高效的果胶提取方法，大大的提高了果胶得率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

无水乙醇均为分析纯；纤维素酶（40U/mg）、半纤维素酶（20U/mg） 上海北诺生物科技有限公司；柠檬酸、柠檬酸三钠、锦灯笼皮产自东北[4]。

微波化学反应器 MCR-3型巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发器 RE-300型上海亚荣生化仪器厂；低速离心机 TDL-40B型上海安亭科学仪器厂；精密电子天平 FA 2004型天津天马恒基仪器有限公司；电热鼓风干燥箱 DHG-9035A型上海一恒科技有限公司；水浴锅DK-S28A型上海精宏有限公司；多功能粉碎机浙江省永康市红太阳机电有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 原料制备

称取100g锦灯笼皮，在沸水中煮10min，除去果皮中色素和杀死果胶当中的酶，冷却至室温，放在50℃电热鼓风干燥箱中烘干。取出干燥的锦灯笼皮置于多功能粉碎机中粉碎，制粉，过60目筛，得锦灯笼皮干粉[5]。

1.2.2 果胶提取

取一定量锦灯笼皮干粉，在一定的pH下，配制成一定料液比溶液，再向其中加入一定量的复合酶与柠檬酸缓冲溶液，置于水浴锅中在特定的温度下处理一段时间，取出放在微波化学反应器中，调节微波化学反应器在一定功率下对混合溶液进行微波辐射，处理一段时间后，取出置于90℃水浴锅中灭酶15min后，开始离心，离心参数为5000r/min，离心3min，重复3次，取上清液，提取液经旋转蒸发仪浓缩至1/3后，用1.5倍90%乙醇洗出，静置沉淀30min后进行抽滤，并用80%乙醇洗涤3次，置于50～60℃干燥箱中烘干，得粗果胶成品[6]。

1.2.3 单因素试验

利用单因素的试验方法确定最佳的复合酶比例，微波辐射时间，复合酶用量，料液比，pH，酶解温度，微波功率、酶解时间。固定实验条件为微波辐射时间为3min、半纤维素酶：纤维素酶=1：1、酶解时间为65min、复合酶用量5mg、料液比1：25、pH4.8、酶解温度50℃、微波功率400w。分别测定各单因素微波辐射时间（1min、2min、3min、4min、5min）加酶比例（1：3、1：2、1：1、2：1、3：1）、酶解时间（45min、55min、65min、75min、85min）、复合酶用量（2.5mg、5.0mg、7.5mg、10.0mg、12.5mg）、pH（4.4、4.6、4.8、5.0、5.2）、料液比（1：15、1：20、1：25、1：30、1：35）、微波功率（240w、320w、400w、480w、560w）、酶解温度（30℃、40℃、50℃、60℃、70℃）对锦灯笼皮果胶提取率的影响。

1.2.4 响应面优化

实验设计采用Design-Expert 8.0.6 软件[7]在不同单因素实验基础上，对锦灯笼皮中果胶的提取进行工艺优化实验设计见Box-Behnken Design实验设计表1。

2 结果分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 微波辐射时间对锦灯笼皮中果胶得率的影响

从图1可以看出，不同的微波辐射时间对锦灯笼皮中果胶提取率影响不同，微波辐射时间的不断增加提取率不断增加，当辐射时间为3min时候，提取率最大，之后下降。这种变化情况可能是因为果皮细胞壁被打破，果胶增多，但随着微波辐射不断延长，锦灯笼皮中果胶的1，4-糖苷键被破坏，果胶结构被破碎成许多小分子果胶，所以锦灯笼皮果胶提取率有所下降。

2.1.2 不同复合酶比例对果胶得率的影响

复合酶比例直接影响了锦灯笼皮中果胶的得率，随着复合酶比例的不断增加，锦灯笼皮果胶提取率不断增加，增加到一定比例后，果胶提取率开始下降。图2显示，最适复合酶比例应选择为1：1。

2.1.3 不同加酶量对果胶得率的影响

在底物浓度一定时，锦灯笼皮果胶提取率随加酶量的增加而升高，由图3可知加酶量达到一定程度时果胶提取率明显减缓，故选择复合酶量的添加量为7.5mg。

2.1.4 微波功率对锦灯笼皮中果胶得率的影响

微波功率对锦灯笼皮果胶得率的影响，果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势，原因在于微波功率在一定范围内与酶产生协同作用提高果胶得率，微波功率过大果胶长链打断，小分子果胶增多，果胶得率下降。图4显示，最适微波功率应选择为400w。

2.1.5 不同料液比对果胶得率的影响

锦灯笼皮果胶提取率随料液比的增加而升高，达到一定料液比时，果胶提取率增加明显缓慢直至平稳，原因在于底物质量一定时，加入过多的溶液进行调配，果胶提取率变化不明显，同时为了节约能源，所以由图5可知，料液比最适为1：30。

2.1.6 不同pH对果胶得率的影响

pH直接影响了果胶的得率，果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势，原因是酶的最适pH一定，随着pH逐渐增大酶的活性增加，果胶得率增加，pH达到一定时继续增加，酶的活性降低，果胶得率下降。图6显示，最适pH应选择为4.8。

2.17 酶解温度对果胶得率的影响

酶解温度影响了果胶的得率，果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势，原因是温度升高提高酶的活性，果胶提取率增加，当温度过高时，酶活力下降，提取率下降。图7显示，最适水浴温度应选择为50℃。

水浴时间影响了果胶的得率，果胶的得率呈现出先升高后下降的趋势，原因是酶解时间过长酶活性下降，果胶提取率下降。图8显示，最适酶解时间应选择为75min。

2.2 响应面实验的结果与分析

2.2.1 Box-Behnken 工艺优化设计结果

实验设计与结果如表2所示。

2.2.2 回归方程与方差分析

根据响应面软件分析得到回归方程如下：Y=9.31+0.40A-0.17B+0.099C+0.066D+0.013AB+0.043AC+0.078AD-0.015BC+0.055BD-0.040CD-0.85A2-0.31B2-0.33C2-0.11D2

得到如表3所示的响应面回归模型和方差分析表，由表可知微波辐射时间、复合酶比例、复合酶用量、微波功率对果胶提取率都有极显著影响，每个决定系数都在可以接受范围之内，由回归方程和方差分析表可知，响应面的优化，可以较好地对锦灯笼皮果胶提取率进行预测[8]。经实验可知微波辐射时间、复合酶比例、复合酶用量、微波功率对果胶提取率影响较大，料液比、pH、酶解时间、酶解温度影响较小[9]。

各交互因素响应面见表3，由表可知 ：微波辐射时间、复合酶比例、复合酶用量、微波功率对锦灯笼皮果胶提取率影响较明显，微波辐射时间直接影响果胶得率。

2.3 最佳工艺条件的确定与验证

利用Design-Expert 8.0.6软件分析模型方程，获得最佳工艺条件为微波辐射时间3.35min、复合酶比例1：1.27、复合酶用量（1：1.27）7.78mg、微波功率399.39w，在此工艺条件下模型的预测值为9.368%。由于最佳工艺条件操作起来困难，所以将条件调整为：微波辐射时间3.4min、复合酶比例1：1.2、复合酶用量7.8mg、微波功率400w、料液比1：30、pH4.8、酶解温度50℃、酶解时间75min，在此条件下，进行平行试验，得到锦灯笼皮果胶的平均提取率为9.35%，比模型的预测值小，说明在实验室进行实验操作，存在一定的环境干扰因素。

2.4 半乳糖醛酸标准曲线绘制

2.4.1 果胶测量方法依据

利用半乳糖醛酸标准品作为对照品，利用分光光度计绘制出标注曲线，测定锦灯笼外皮提取物中果胶含量[10]。

2.4.2 配制半乳糖醛酸标准溶液

称取0.1000g半乳糖醛酸标准品，加超纯水溶解，转移到100mL容量瓶中，定容。取上述溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL、6.00mL分别加入6个100mL容量瓶中，定容，即得到浓度分别为10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL标准溶液[10]。

2.4.3 绘制标准曲线

分别移取6mL浓硫酸与6个比色皿中（2～7号，1号比色皿中加入超纯水作为空白对照），分别缓慢加入10ug/mL、20ug/mL、30ug/mL、40ug/mL、50ug/mL、60ug/mL的半乳糖醛酸标准溶液1mL，将所配的半乳糖醛酸标准溶液置于沸水水浴锅中一段时间后取出，降到室温加入0.15%咔唑乙醇溶液0.5mL。利用分光光度计在波长为530nm测定吸光值，结果如表4，绘制出标注曲线如图15，计算得其线性回归方程为：y=0.0076x+0.0126

2.4.4 测定锦灯笼皮果胶粗产品中半乳糖醛酸的含量

称取果胶粗产品0.2500g，用50mL无水乙醇充分拌匀，在90℃时恒温水浴锅中水浴30min，取出冷却到室温，再用抽滤机对所配溶液进行抽滤，将所得物质用无水乙醇洗涤转移到烧杯当中，加入100mL盐酸使果胶粗产品进行水解，再将上述溶液转移至250mL容量瓶中，开始定容，将溶液稀释20倍，待测。利用分光光度计对所得溶液进行吸光度的测量，测定出特定浓度溶液的吸光度值，利用y=0.0076x+0.0126 R=0.9978计算出锦灯笼

3 结论

实验表明在标准曲线绘制时，在530nm处吸光度值最大，利用分光光度计测定不同浓度半乳糖醛酸标准品溶液的吸光度值，计算出其线性回归方程为：y=0.0076x+0.0126，R= 0.9978。

用东北地区所产的锦灯笼提取果胶时，提取率约为9.368%，其中果胶含量约为 63.02%，RSD为5.15%，表明回收率高，结果较准确。

采用微波辅助复合酶法提取锦灯笼果皮中果胶能有效的提高提取率，利用响应面法对工艺条件进行优化，果胶得率进一步提高。

微波辅助复合酶提取锦灯笼皮果胶的工艺优化研究发现了一种高效、环保提取锦灯笼皮果胶的方法，大大提高了果胶得率。

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