中国西门塔尔太行类群牛肉质性状与SLC27A1基因多态性关联分析

张喜忠　王曦　张元庆　杨效民　王栋才　靳光　李博　徐芳　程景

摘要：为探索SLC27A1基因对牛肉质性状的影响，选取中国西门塔尔牛太行类群牛公牛、阉牛各20头为研究对象，采用PCR法分析SLC27A1的基因遗传多态性。检测到SNP位点为S5650：T>C，该位点存在有3种基因型，其中CC基因型频率较高（62.5%），TT基因型频率最低（12.5%）。采用GLM对内质相关性状与SLC27A1基因进行关联分析，结果表明，剪切力、肉色a、肉色b表型中，CC与TT及CT与丌差异均极显著（P<0.01），其他性状间差异不显著（P>0.05），阉牛与公牛间对肉质的弹性与咀嚼性差异显著（P<0.05）。采用Real-time PCR分析，CC基因型在肌肉与脂肪中的表达量比基因型CT与TT差异显著（P<0.05），阉牛与公牛之间的表达量在肌肉中差异极显著（P<0.01）。SLC27A1基因S5650：T>C位点突变对中国西门塔尔牛太行类群肉质性状存在一定的遗传效应，

关键词：SLC27A1基因；肉质性状；SNP；中国西门塔尔太行类群

SLC27A1（S0lute carrier family 27 member 1），又称作FATP（Fatty acid transpon pmteins），是脂肪酸运输蛋白家族成员，具有调节长链脂肪酸在机体局部和全身系统中新陈代谢的作用。提纯的SLC27A1具有类似乙酰辅酶A的活性，并通过催化机体内双层分子膜中的脂肪酸不断转化成脂肪酸乙酰辅酶A来加快脂肪酸的吸收。通过组织中SLC27A1的活化作用，可以促使胰岛素调控长链脂肪酸的摄入，且SLC27A1具有分配脂肪酸到机体各组织中的作用。SLC27A1基因敲除小鼠脂肪组织中的脂滴半径小于正常小鼠，且在低温环境下维持体温恒定的能力很差，这说明SLC27A1在运送长链脂肪酸通过质膜维持能量平衡、产生热量等生理过程中起着至关重要的作用，是脂肪代谢的重要调节因子。SLC27A1基因失活的小鼠可免受食源性肥胖的困扰。

Ordovas等为获得牛的SLC27A1的DNA片段，利用人类该基因的mRNA序列扩增了一段505bp牛的该基因片段并扫描了牛的BAC文库，得到了包含SLC27A1的BAC克隆，并将SLC27A1基因定位于染色体7q11-q12上，该基因有12个外显子，编码646个氨基酸，近年来已在7号染色体上发现了一些与脂肪代谢相关联的性状位点（QTL）。

本研究利用PCR测序技术针对西门塔尔太行类群杂交牛的SLC27A1基因进行扩增，采用测序技术进行基因型检测，将不同基因型与脂肪相关性状进行关联分析，以期找到与产奶性状相关的分子标记，以期为标记辅助选择在提高肉质性能上的应用提供理论依据。

1.材料与方法

1.1试验材料

1.1.1试验动物与屠宰检测 迅速取刚屠宰后的中国西门塔尔太行类群牛公牛、阉牛各20头，每头牛血3 mL，2mLACD抗凝，保温箱中带回，用于提取基因组DNA。取眼肌部位10 cm3肉送检。取眼肌肉与皮下脂肪各0.5 g，放入液氮冷冻后置于-80℃保存。

1.1.2引物 SLC27A1基因比较保守，不同物种间编码区差异较小，所以使用小鼠同源序列设计SLC27A1引物，其扩增片段信息及B-actin基因引物如表1所示，B-actin基因引物根据文献获得。

1.2SLC27A1基因型检测

1.2.1PCR扩增 PCR反应体系：在100uLEP管中加入10×PCR缓冲液2.0uL、2.5 mmol/L dNTP1.6uL、Tag DNA聚合酶1 U/uL、上下游引物各30ng、基因组DNA约100 ng、加去离子水至总反应体积20uL。反应程序为：94℃预变性5 min，35个循环（94℃变性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸90 s），72℃延伸10 min，4℃保存。取2uLPCR产物与0，5uL溴酚蓝缓冲液混匀，0.8%琼脂糖凝胶，110 v电泳0.5 h后，紫外灯下观察有无扩增产物。

1.2.2PCR产物的回收测序 PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收，将回收得到的PCR产物与pMDl9T-vector连接，经转化，摇菌，菌液送北京奥科生物有限公司进行测序，检测样品的SNP基因型。

1.3定量的方法及标准曲线的制作

1.3.1牛皮下脂肪RNA的提取 按照QIAGEN脂肪RNA提取试剂盒说明书步骤进行，采用Trizol一步法提取牛皮下脂肪与肌肉中总RNA。

1.3.2标准阳性质粒的制备、标准曲线的建立及定量PCR 将制备的阳性标准品质粒进行10倍梯度稀释，取1010至1038个稀释度作为标准模板，同时设阴性对照。PCR反应体系为：SYBR Green Master Mix 7.5uL，上游引物0.3uL，下游引物0.3uL，组织cDNA或B-actin质粒模板1.0uL，加无菌水至15uL。反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共40个循环。溶解曲线反应：55℃30 s：每30 s提高0.5℃至95℃，共81个循环。为了保证每个组织目的基因相对表达的可重复性，消除因加样造成的误差，每个样品的检测设3个重复。Real-time PCR的产物特异性通过凝胶电泳结合溶解曲线分析加以验证。

1.4统计分析

1.4.1SLC27A1基因多态性分析 根据测序结果，得出SLC27A1基因不同基因型，然后计算基因频率与基因型频率。

3.讨论

3.1SLC27A1基因多态性及群体遗传特性分析

本研究以牛的SLC27A1基因作为影响肉牛肉质性状的候选基因，借助PCR测序技术对部分SLC27A1基因进行了检测，检测得到1个SNP位点S5650：T>C，可能由于样品少的原因，TT型频率较低，不能反映整个牛群的遗传结构，但也可能因为中国西门塔尔太行类群牛在品种形成过程中，亲本祖先地域与亲缘关系上较远，经过3～4代的结合，还没有实现遗传上的哈一温平衡，造成基因频率与基因型频率的特异性。

3.2SLC27A1基因与肉质性状的相关性分析

阉与否对肉质的弹性与咀嚼性差异显著，也能说明，阉牛对肉质性状的影响，阉牛的肉质更具有弹性与可咀嚼性。基因型与表型差异不显著，可能是反映真实的一种情况，但也有可能是由于样本量少，样品的检测结果存在较大的方差，使得统计差异不显著。基因型与表达量的方差分析表明，CC型表达差异显著，可能CC基因型影响SLC27A1基因在肌肉与脂肪中的表达，表达量的变化可能会影响脂肪在肌肉组织与脂肪组织中的沉积。wsng等发现SLC27A1基因表达部位与年龄存在一定关系，说明SLC27A1基因在不同时期在不同鸡组织部位影响脂肪的代谢，但是在肉质检测的表型统计中差异不显著，这可能与采样及样本的数量有一定关系，还需进一步研究。

因为SLC27A1基因与脂肪的作用有关，Ordovds等于2005将SLC27A1基因定位于牛的第7号染色体上，2008年在荷斯坦与西班牙两个牛品种Asturiana de los Valles和MenorUuina中发现SLC27A1基因不会影响乳脂含量。吕延飞等对SLC27A1基因SNPs与中国荷斯坦奶牛产奶性状进行关联分析，首次在3UTR发现了G64A位点，exon3的T112c位点的c等位基因对产奶量起到正效应，通过提高cc基因型频率有望提高中国荷斯坦奶牛的产奶量。由此推断，SLC27A1基因可作为影响中国荷斯坦奶牛产奶量的候选基因，进行更深入的研究。Lv等、Ordovas等将SLC27A1作为候选基因，在中国荷斯坦奶牛中研究发现两个SNP位点，其中等位基因C与奶牛的产奶性状有关，CC基因型产奶量差异显著。zhang等在安格斯与和牛杂交一代中研究30个复合表型，发现SLC27A1基因影响肉中油酸Oleic acid含量（P=0.0155），从而影响肉的风味与肉质。

针对SLC27A1基因在中国西门塔尔牛太行类群的群体分析，检测到一个SNP位点S5650：T>C，同时检测到基因型为CC、CT与TT。统计结果表明，剪切力表型中CC与TT差异极显著（P>0.01），肉色a、肉色b表型中，CC与TT、CT与TT差异均极显著（P<0.01）。阉与否对肉质的弹性与咀嚼性差异显著（P<0.05），与肉样品的pH、硬度1、硬度2、内聚性、胶粘性等表型值的相关分析，结果表明差异不显著（P<0.05），需扩大样本继续研究。从总的表型与基因型分析看，CC型对应的肉质性状表现为肉色值低、剪切力高、熟肉率高、弹性强等特点。

3.3荧光定量

由于SLC27A1基因功能的特殊性，不同组织和器官中其表达量不同，在一些快速代谢脂肪酸的组织器官，如心脏、肌肉、脂肪组织中表达量最高。转基因鼠心脏过度表达SLC27A1会引起心肌炎。而SLC27A1基因的表达量中，不同基因型之间在肌肉与脂肪中的表达量差异显著（P<0.05）。该基因在阉牛肌肉中的表达量存在极显著差异，可能会影响到牛肉的肉质性状。是否可以用于分子选育，还需进一步的研究，

4.小结

本研究采用基因SNP位点检测方法，对40头牛个体的SLC27A1基因部分区段进行遗传变异检测，采用GLM模型分析SLC27A1基因S5650：T>C位点突变对中国西门塔尔牛太行类群的部分屠宰与肉质性状的效应，发现该位点基因型及等位基因频率分布在群体间表现出较大的差异性，SLC27A1基因S5650：T>C位点突变对中国西门塔尔牛太行类群部分肉质性状有较大的遗传效应，可进行进一步验证，用于肉牛品种培育过程中标记辅助选择，也可作为改善牛肉质量的重要候选基因，但有关该位点遗传效应差异、影响的分子机制及突变对动物体脂肪合成的生理生化作用方面值得进一步深入研究。