生鲜蔬菜消毒方法的比较

吴思　程妍　石健春　冯秋实　周颖　王小红　李锦铨

摘要：利用大肠杆菌（Escherichia coli）构建生鲜蔬菜消毒过程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用传统消毒方法单独处理被污染的水或蔬菜，分别比较其灭菌效率，并探究在传统消毒方法的基础上加入噬菌体进行辅助处理，分析其灭菌效率。结果表明，水污染模型中，0.004%硝酸银的消毒效果最理想，灭菌率超过90%；6种不同杀菌方式对菠菜的杀菌效果最好，其次是生菜、香菜。蔬菜污染模型中，0.10%硝酸银的消毒效果最理想，灭菌率超过85%，对生菜的杀菌效果最好，其次是香菜、菠菜。两种不同的模型中，加入噬菌体M13K07辅助作用，均可以提高硝酸银、次氯酸钠和紫外照射单独作用的灭菌率。

关键词：生鲜蔬菜；消毒；大肠杆菌（Escherichia coli）；噬菌体

生鲜蔬菜是人体营养物质、维生素、膳食纤维的重要来源，在中国农业生产中占有重要地位。近年来，中国生鲜蔬菜生产、流通和销售得到了长足发展，己经成为世界上第一大生鲜蔬菜生产国。蔬菜在生长过程中，因使用农药和在摘取、包装、运输、销售过程中的损坏，往往会被污染，其污染程度与蔬菜的表皮是否破损有关。表皮破损的蔬菜，细菌污染率较高，消毒不彻底易导致肠道传染病的发生。如何消除蔬菜表面的病原菌，在保证生鲜蔬菜的食用安全性下最大限度地保持蔬菜的营养价值具有重要的现实意义。

净菜也称新鲜消毒蔬菜，即用新采摘的蔬菜，经过整理（去掉不可食部分、切分等）、洗涤、消毒等加工操作，在无菌环境中，真空包装而制成的一种产品。净菜在生产过程中，常使用的消毒方法是紫外照射和化学试剂处理，但是紫外线的灭菌作用只在其辐照期间有效，净菜被处理后容易遭受二次污染。化学物质虽然可以达到持续消毒的目的，但在一些产业中，如水产养殖和食品工业等，不需要化学消毒剂的持续消毒。有研究报道，一些蔬菜经次氯酸钠消毒处理后，有高浓度三氯甲烷生成，产生食品安全隐患。

噬菌体是一类感染其他病毒或细菌细胞的病毒总称，其遗传结构简单，生命周期短，并且都以蛋白质外壳包裹的DNA或RNA为遗传物质，可从污水等自然环境或者食品原料中提取到，其特异性强、自我增殖快，具有专一性、裂解性，即将成为新一代天然、绿色、安全抗菌制剂。近年来，有关于应用噬菌体制剂对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等各种细菌性感染治疗的报道，其成功率均很高。美国食品和药物管理局已经同意将噬菌体用于肉类食品的储备。然而中国关于噬菌体的研究应用较少。

因此，本试验构建生鲜蔬菜消毒过程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用传统消毒方法单独处理被污染的水或蔬菜，分别比较灭菌效率，并探究在传统方法的基础上加入噬菌体进行辅助处理，比较其灭菌效率，以期为生鲜蔬菜消毒，减少由病原菌引发的食源性疾病提供参考依据。

1.材料与方法

1.1材料

试验菌株为大肠杆菌地方分离菌株1、大肠杆菌地方分离菌株2、大肠杆菌噬菌体M13K07，购于北京宝科维食安生物技术有限公司。

1.2试剂与仪器

安琪胰蛋白胨、安琪酵母浸粉购自安琪酵母股份有限公司，琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限公司，NaCl等其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

紫外灯（254 nm，15 W，Philips TUVl5 W G15T8）、打孔器（直径0.7 cm）、生物分光光度计（Eppendorf AG 22331 Hamburg）均购自艾本德中国有限公司。

1.3方法

1.3.1噬菌体生物学特性

1）噬菌体效价：取500ul对数期大肠杆菌菌液（OD为1.0），以及100ul噬菌体稀释液（稀释倍数为10^-6～10^-9），充分混匀，37℃120 r/min振荡培养30 min。然后加入3 mL溶解好的42℃的2xYTTopAgar，振荡均匀，立刻倒平板，37℃培养过夜，计算噬菌斑的数目。

噬菌体效价（PFU/mL）=噬菌斑数×稀释倍数x10

2）噬菌体pH稳定性试验：取EP管，分别加入不同pH（4、5、6、7、8、9、10）的2xYT培养基100μL，然后将EP管置于37℃恒温水浴中：待温度平衡后加入100μL的噬菌体稀释液（10⁹PFU/mL），恒温保存2 h。待作用时间结束后取样，测定处理后的噬菌体效价。

3）噬菌体紫外耐受性试验：取噬菌体稀释液（10⁹PFU/mL）10mL于培养皿中，距离培养皿35 cm处，采用紫外灯照射，间隔15 min取样，测定噬菌体效价，共取样4次。

1.3.2消毒剂单独作用对生鲜蔬菜的影响 取大肠杆菌菌液稀释液（10⁴CFU/mL），分别进行如下处理：①1 mL菌液分别加入2、5、10μL浓度为2%的AgN03溶液，作用10 min；②1 mL菌液分别加入10、20、40μL浓度为5%的NaCl0溶液，作用10 min；③30 mL菌液置于培养皿中，距离培养皿35 cm处，采用紫外灯照射，间隔5 min取样，取样时间分别为0、5、10、15、20、25、30 min。然后分别加入生菜、菠菜和香菜各两片，摇床（120 r/min，37℃）作用30 min后，取出叶片，研磨充分，加入500 μL2xYT培养基，取100μL涂平板计数。

1.3.3净菜生产过程中处理被污染水的消毒方法取大肠杆菌菌液稀释液（10⁴CFU/mL），对污水进行以下6种不同的消毒处理：①1mL菌液加入2μL2%AgNO₃作用10min；②1 mL菌液加入5μL噬菌体（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入2μL2%AgNO₃作用10min；③1mL菌液加入20μL 5%NaCl0作用10min；④1 mL菌液加入5μL噬菌体（10⁴PFU/mL）作用30min，再加入20μL 5%NaCl0作用10min；⑤取10 mL菌液，距离35 cm用紫外灯处照射，作用30min；⑥取10mL菌液，距离35 cm用紫外灯照射，作用30 min后，取1 mL菌液加入5μL噬菌体（104 PFU/mL）作用30 min。对照组不做任何处理。待作用时间结束后，每种处理方式分别加入生菜、菠菜、香菜，摇床（120 r/min，37℃）作用30 min后，取出叶片充分研磨，加入500μL2xYT培养基，取100μL涂平板计数。

1.3.4净菜生产过程中处理被污染蔬菜的消毒方法 将一定数量的蔬菜叶片浸入大肠杆菌菌液稀释液（10⁴CFU/mL）中，摇床120 r/min（37℃）作用30 min。之后分别取出被污染的生菜、菠菜、香菜叶片进行以下6种不同的消毒处理：①1 mL 2xYT培养基加入5 uL2%AgN03作用10min；②1 mL2xYT培养基加入5uL噬菌体（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入5uL2%AgNO₃作用10 min；③1 mL 2xYT培养基加入40 μL 5%NaCl0作用10 min；④1 mL2xYT培养基加入5μL噬菌体（10⁴PFU/mL）作用30 min，再加入40 μL 5%NaCl0作用10 min；⑤取生菜（4片）、菠菜（2片）、香菜（2片）距离紫外灯35 cm处照射，作用30 min；⑥取生菜（4片）、菠菜（2片）、香菜（2片）距离紫外灯35 cm处照射30 min后，取出叶片加入1 mL 2xYT培养基和5 μL噬菌体（10⁴PFU/mL）作用30 min。对照组不做任何处理。待作用时间结束后，取出叶片，研磨充分，加入500 μL2xYT培养基，取100 μL涂平板计数。灭菌率=（对照组菌落数-处理组菌落数）/对照组菌落数×100%。

1.4数据分析

采用GraphPad Prism5软件分析数据并绘制图表。

2.结果与分析

2.1噬菌体基本生物学特性

2.1.1噬菌体效价 噬菌体基本生物学特性如图1所示，噬菌体效价如图1A所示。由图1A可知，空斑平均数为496个，菌落数计数平板的稀释倍数为10^-9，故噬菌体效价为4.96×10¹²PFU/mL。

2.1.2噬菌体pH稳定性 噬菌体对于pH的稳定性结果如图1B所示。由图1B可知，噬菌体在pH为7-8时稳定性较好，在酸性及碱性条件下，其效价逐步下降：在pH小于5或大于10时，其效价下降明显。

2.1.3噬菌体紫外耐受性 噬菌体的紫外耐受性试验结果如图1c所示。由图1c可知，紫外照射60min使噬菌体的效价下降一个数量级，并且随着照射时间的增加，噬菌体的效价逐步下降。因此，在后面的消毒方法中，先用紫外照射，然后加入噬菌体进行处理。

2.2不同消毒方法单独作用对生鲜蔬菜的影响

2.2.1不同浓度的硝酸银对生鲜蔬菜的影响 消毒剂单独作用对生鲜蔬菜的影响如图2所示，不同浓度的硝酸银对生鲜蔬菜的处理结果如图2A所示。由图2A可知，硝酸银浓度越高，灭菌效果越好：同一浓度的硝酸银对于生菜的灭菌效果最为理想，菠菜次之，香菜最差。

2.2.2不同浓度的次氯酸钠对生鲜蔬菜的影响不同浓度的次氯酸钠对生鲜蔬菜的处理结果如图2B所示。由图2B可知，次氯酸钠浓度越高，灭菌效果越好：0.20%次氯酸钠对于香菜的灭菌效果最为理想，中、高浓度的次氯酸钠对于生菜的灭菌效果较为理想。

2.2.3不同时间的紫外照射对生鲜蔬菜的影响不同时间的紫外照射对生鲜蔬菜的处理结果如图2c所示。由图2c可知，紫外照射时间越长，灭菌效果越理想。

2.3不同处理方法对被污染水及蔬菜的消毒效果比较

不同处理方式对被污染水及蔬菜消毒效果的比较如图3所示。将被污染水进行6种不同方式的消毒处理，比较结果如图3A所示。由图3A可知，0.004%硝酸银处理10 min和0.5%噬菌体消毒30min+0.004%硝酸银消毒10 min的消毒效果较理想，灭菌率均超过90%：其次是0.10%次氯酸钠消毒10 min和0.5%噬菌体消毒30 min+0.10%次氯酸消毒10 min，紫外灯处理的消毒效果相对较低，但灭菌率也超过80%。6种不同处理方式对菠菜的灭菌效果最理想，其次为生菜、香菜。另外，加入噬菌体M13K07辅助作用，可以适当提高硝酸银、次氯酸钠和紫外照射单独作用的灭菌率，对3种生鲜蔬菜平均提高率分别为2.1、1.9、1.7个百分点。

2.4不同的处理方法对被污染蔬菜消毒效果的比较

将被污染蔬菜进行6种不同方式的消毒处理，比较结果如图3B。由图3B可知，0.10%硝酸银处理10 min和0.5%噬菌体消毒30 min+0.010%硝酸银消毒10 min的消毒效果较理想，灭菌率超过85%：其次是0.20%次氯酸钠消毒10 min和0.5%噬菌体消毒30 min+0.20%次氯酸消毒10 min，灭菌率也超过85%，紫外灯处理的消毒效果相对较低，灭菌率超过80%。6种不同处理方式对生菜的灭菌效果最理想，其次为香菜、菠菜。另外，加入噬菌体M13K07可起到辅助作用，可以提高硝酸银、次氯酸钠和紫外照射单独作用的灭菌率，分别提高2.4、2.3、2.9个百分点。

3.小结与讨论

本试验分析了噬菌体的基本生物学特性，并利用大肠杆菌构建生鲜蔬菜消毒过程中水污染模型和蔬菜污染模型，使用传统消毒方法单独处理被污染的水或蔬菜，分别比较其灭菌率，并探究在传统消毒方法的基础上加入噬菌体进行辅助处理，能否提高其灭菌效率。结果表明，水污染模型中，0.004%硝酸银处理10 min的消毒效果最理想，灭菌率超过90%：6种不同处理方式对于菠菜的灭菌效果最理想，依次为生菜、香菜。蔬菜污染模型中，0.10%硝酸银处理10 min的消毒效果最理想，灭菌率超过85%：6种不同处理方式对于生菜的灭菌效果最理想，依次为香菜、菠菜。另外，两种不同的模型中，加入噬菌体M13K07可以提高硝酸银、次氯酸钠和紫外照射灭菌率约2个百分点，并且蔬菜污染模型中提高的幅度略高于水污染模型。

大肠杆菌对净菜生产过程以及广大消费者均存在不可忽视的潜在威胁，因此，应当建立完善的消毒体系。在净菜生产过程中，可以选用0.004%硝酸银处理10 min，并加入0.5%噬菌体处理30 min，灭菌效果最为理想。同时，可以将0.10%硝酸银与0.5%噬菌体制成混合喷雾剂，用于家庭式对生鲜蔬菜的消毒。