细菌毒力与细菌数量对鸡胚致死率的影响

李筱筱　高霞　康燕青　张皎皎　樊琛　郑焕芹

摘要：将不同来源的鸡大肠杆菌梯度稀释后进行鸡胚致死率试验，探讨细菌毒力与细菌数量对鸡胚致死率的影响。结果表明，大肠杆菌菌数在100～1 000CFU范围内，菌数与其致病力间相关性不显著（P>0.05），鸡胚死亡率表现为菌株毒力的影响。

关键词：大肠杆菌：细菌数量：致病性

鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的鸡感染性疾病的总称，是养鸡生产中常见的一种传染病，易给养禽业造成严重的经济损失。菌株致病性通常采用雏鸡致死率检测，其结果受环境影响大，若采用鸡胚代替雏鸡，对环境条件要求低，本试验探讨了通过鸡胚致死率检测鸡大肠杆菌致病性的可行性。

1.材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源 SD5、SD6、SD24、SD26、SD27、SD30、SD31、SL3共8株采集于山东地区健康鸡粪便：cvcc1551、cvcc1553、cvcc1562、cvcc1568、01、078购于中国兽医药品监察所；02、新大、田大、北京1、北京3、贵州1分别为来自北京、黑龙江省、贵州省3个发病鸡场分离的强毒株，由东北农业大学预防兽医教研室保存；E1、E4、HLl、HL3、HL6、HL7、HL8、HL9、HL10、HL12、HL13、HL16、HL19、HL21、HL22、HL23、HL24、HL25、HL27、HL28、HL29、HL30、HL32、HL33、HL34共25株菌株从外观健康的不同雏鸡粪便中分离鉴定获得，由东北农业大学预防兽医教研室保存；BL21、TG1为感受态细菌。

1.1.2试剂 伊红美蓝培养基、麦康凯培养基、营养肉汤培养基、普通营养琼脂、生化试验鉴定管、各种生物化学试剂均购自青岛海博生物技术有限公司。

1.1.3试验动物 12日龄SPF鸡胚购于聊城阳谷。

1.2方法

1.2.1大肠杆菌的活化 按文献[2]方法进行，在无菌的条件下取待测的大肠杆菌，用接种环挑取平板上的单菌落，在普通营养肉汤中37℃摇床过夜培养10～12h至成熟期。

1.2.2大肠杆菌梯度试验 取高致病性菌株02和感受态菌株TG1，1000μL菌液4 000 r/min离心2 min，弃去上清液，取沉淀用生理盐水清洗2次，进行10倍倍比稀释。取0.1 mL稀释液经尿囊腔注射12日龄SPF鸡胚，每组10只，同时取0.1 mL稀释液涂板，做细菌计数。并做对照组，注射生理盐水，共注射10只。然后于37℃培养箱培养，记录每天的死亡数，至第四天，记录胚胎的死亡率。

1.2.3细菌数量与鸡胚致死率相关性试验 取47株不同来源的鸡大肠杆菌的菌液1 000μL，4 000r/min离心2 min，弃去上清液，取沉淀用生理盐水清洗2次，稀释至细菌数100-1 000 CFU。按“1.2.2”方法进行鸡胚致病性试验并记录结果，判断细菌数在100～1 000 CFU范围时，细菌数量与鸡胚致死率的相关性。

1.2.4不同来源的鸡大肠杆菌毒力试验 分别取高致病性菌株01、02、078、cvccl551、cveel553、cvc1562、cvee1568和非致病菌株BL21、TG1、E4，按“1.2.2”方法进行鸡胚致病性试验，记录鸡胚的死亡率。

1.2.5重复性试验 10 d后，选取HL22、HL24、E1、02、TG1，按“1.2.2”方法进行重复性试验。

2.结果与分析

2.1大肠杆菌梯度试验

由表1可知，高致病性菌株02菌数在10³～10⁵CFU范围内时，鸡胚死亡率随着菌数的升高而降低，其菌数在8-490 CFU范围内鸡胚死亡率随菌数的升高而升高：对于感受态菌株TG1，其菌数在10³～10⁶CFU范围内鸡胚死亡率随菌数的升高而降低，在10～10⁴CFU范围内鸡胚死亡率随菌数的升高而升高。注射生理盐水的对照组鸡胚在观察时间内没有死亡。结果表明，细菌菌数在100～1 000CFU范围内，高致病性菌株的鸡胚死亡率高达80%：而感受态菌株的鸡胚死亡率最高为30%，即注射菌数在100～1 000CFU范围内可区分高致病性菌株与无（或低）致病性菌株。

2.2细菌数量与鸡胚致死率相关性试验结果

各组鸡胚接种细菌后，胚胎死亡多集中于接种后的第二天和第三天，注射生理盐水的对照组鸡胚在观察时间内没有死亡，见表2。经Spss软件分析，大肠杆菌的菌数与其致病力间相关性不显著（P=0.590>0.05）。即注射大肠杆菌菌数在100～1 000CFU范围时，鸡胚致死率与注射菌数不相关。

2.3不同来源的鸡大肠杆菌毒力试验结果

高致病性菌株鸡胚死亡率高达40%-80%：而非致病性菌株的死亡率为0%～30%，注射生理盐水的对照组鸡胚在观察时间内均无死亡（表3）。由表2和表3可见，大肠杆菌菌数在100-1 000 CFU范围内时，鸡胚致死率与菌数不相关，与细菌毒力相关。

2.4重复性试验结果

在菌数100-1 000 CFU范围内，各菌株的鸡胚致死率变化幅度均在20%内，即重复性可接受，见表4。重复性试验结果进一步表明，鸡大肠杆菌菌数在100～1 000 CFU范围内与鸡胚致死率不相关，即鸡胚致死率表现为大肠杆菌毒力而非菌数的影响。鸡胚致死试验可反映大肠埃希菌的毒力强弱，即鸡胚致死率可作为检验鸡大肠埃希菌致病力强弱的一种方法。

3.讨论

为探讨大肠杆菌毒力与细菌数量对鸡胚致死率的影响，采用鸡胚注射的方法。致死率试验通常选择小鼠、家兔、鸡等试验动物。将动物随机分组，同时设对照组和攻毒组，在试验期内观察动物死亡情况。如李玉文等在辽宁省禽大肠埃希氏菌血清型的调查及其致病性试验中，对300只1日龄SPF雏鸡于气管内注射并观察7 d，结果表明，给每只试验鸡于气管内接种0.1 mL培养物后第12 h试验鸡主要表现精神沉郁、呼吸困难、喘气、垂翅、竖毛、食欲下降或废食，或排灰白色稀便。高致病性分离株引起接种鸡死亡的高峰在接种后第12～24 h。所有分离菌株均有致病性。高崧等在中国部分地区禽病原性大肠杆菌分离与鉴定中，以每分离株107菌落形成单位（CFU）细菌气管内接种1日龄无特定病原体（SPF）鸡6羽，根据接种后7 d内发生死亡和病变鸡的比例，确定出高致病株、中度致病株和低致病株分别为83.33%、10.00%、6.67%。高致病性分离株引起接种鸡死亡高峰在12～24 h，表明菌株毒力存在差异。此方法应用较多，虽然能够模拟细菌攻毒的机制，但存在占地大、受环境影响明显，成本高，饲养条件不易控制等因素。鸡胚致死试验国内外相关研究资料较少，本试验采用鸡胚代替雏鸡，对环境条件要求低，占地少。结果显示，采取鸡胚致死率作为检测鸡大肠杆菌致病性的方法是可行的。樊琛等在把鸡胚致死率作为检验鸡大肠埃希菌致病力指标的探讨中采用SPF级12日龄鸡胚和1日龄公雏鸡分别接种鸡大肠埃希菌，检测20株鸡大肠埃希菌菌株对12日龄鸡胚和1日龄公雏鸡的致死率的相关性，结果显示雏鸡致死率与鸡胚致死率相关。鸡胚致死试验可反映出大肠埃希菌的毒力强弱，即鸡胚致死率可作为检验鸡大肠埃希菌致病力强弱的一种方法。雏鸡致死率与鸡胚致死率有相关性。尽管细菌对鸡胚的致死机制还不清楚，可能其致死机制与细菌在人体和动物体中的致病机制不同，但鸡胚致死率仍与细菌毒力相关。

试验先通过对已知的高致病性菌株02和感受态菌株TG1进行梯度试验，结果显示，细菌菌数在100-1 000 CFU范围内，菌数与死亡率不相关。再随机选取47株不同来源的鸡大肠杆菌，控制其菌数在100～1 000CFU范围内对12日龄SPF鸡胚进行致病性试验，经Spss软件分析，P=0.590>0.05，即进一步表明大肠杆菌菌数在合理的范围内与鸡胚致死率无关。并通过多数胚胎致死试验表明，活菌数在100～500CFU之间的注射量变化对胚胎的死亡率没有明显影响。同时，对10株不同来源的高致病性菌株与非致病性菌株进行鸡胚致死率试验，结果显示，在控制菌数100-1 000 CFU范围内的条件下，鸡胚死亡率表现为菌株毒力的影响。高致病性菌株鸡胚死亡率高达40%～80%：而非致病性菌株的死亡率为0%-30%，不同大肠杆菌分离株的致病性存在明显的差异。重复性试验结果显示，在菌数100-1 000CFU范围内，各菌株的鸡胚致死率变化幅度均在20%内。Penelop等采用在间隔一周的时间条件下，对菌数和胚胎死亡率进行重复性试验，结果显示，胚胎死亡数量的变化发生在重复性试验中，即在0%-40%范围内这种重复性是可接受的。大肠杆菌菌数在100～1 000 CFU之间的注射量变化对胚胎的死亡率没有明显的影响。鸡胚致死率表现为大肠杆菌毒力的影响而非菌数的影响，鸡胚致死试验可反映出大肠埃希菌的毒力强弱，即鸡胚致死率可作为检验鸡大肠埃希菌致病力强弱的一种方法。