木通属植物种质资源的SRAP分析

黄佩蓓　陈世华　王飞　曾贤

摘要：采用SRAP标记技术，对木通属25份药用植物材料进行遗传多样性分析。结果表明，在选用的12对引物中，共检测到173条多态性条带，多态性比率达83.2%，相似系数变化范围为0.275 8～0.931 0，UPGMA聚类分析将25个供试样品分为二类：五叶木通为一类，白木通和三叶木通聚为一类：SRAP标记适合木通属植物的遗传多样性、亲缘关系分析。

关键词：木通属；相关序列扩增多态性（SRAP）；遗传多样性

木通属植物作为中国传统中药材，目前国内外研究的主要有3种：木通（俗称五叶木通）、三叶木通及其变种白木通。随着分子标记技术的发展，近年来RAPD、AFLP分子标记技术相继成功应用于木通属植物的研究，但RAPD稳定性差、扩增产率低，AFLP技术复杂，使其应用受限。SRAP（Sequence-related amplified polymorphism，相关序列扩增多态性）是一种新型的分子标记技术，它结合了RAPD和AFLP分析的优点，操作简便、结果稳定、中等产率、成本低，目前已被广泛应用，但利用SRAP标记技术分析木通属植物遗传多样性的研究尚未见报道。为此，运用SRAP标记技术分析25份木通属药用植物的遗传多样性，旨在为木通属药用植物的选种栽培提供参考，并探讨SRAP标记在木通属药用植物种质资源研究中的可行性。

1.材料与方法

1.1材料

供试材料均采自江西省境内，由江西中医药大学赖学文教授鉴定。具体材料名称及来源地见表1。

1.2方法

1.2.1DNA提取 取新鲜嫩叶约0.1 g，参照王飞等的方法分别提取不同材料的总DNA。

1.2.2SRAP分析 SRAP引物采用Li等公布的序列，由上海生物工程技术服务有限公司合成（表2）。

SRAP-PCR反应体系（25 μL总体积）：模板DNA90 ng，dNTPs 200 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 u，引物0.4 μmol/L，10xPCR Buffer 2.5 μL，其余用ddH2O补齐。SRAP-PCR扩增反应程序：94℃预变性3 min；94℃1 min，35℃1 min，72℃2 min，5个循环；94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，35个循环：72℃延伸10 min；4℃保存。PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外凝胶成像系统上观察和记录。

1.2.3数据处理 根据PCR扩增结果，每个样品的扩增带数按有带赋值为“1”（强带和弱带同记），无带为“0”，建立“1”和“0”型数据。利用NTSYS软件计算相似系数，用UPGMA进行聚类分析，构建树状图。

2.结果与分析

2.1SRAP多态性分析

采用42对引物组合对25份木通属植物材料进行扩增，其中12对引物组合可扩增出清晰的多态性条带，扩增结果及多态性信息见表3。从表3可以看出，共检测到清晰条带208条，其中多态性条带173条，平均每对引物产生14.4条多态性条带，平均多态率为83.2%，表明木通属植物具有较为丰富的遗传多样性。不同引物组合扩增条带大小集中在100～1 400bp。

引物组合Me4-Em8扩增结果见图1。图1表明，SRAP分子标记能检测出较多的木通属植物的遗传位点，获得多态性相对较好的PCR结果，SRAP标记适合木通属植物的遗传多样性分析。

2.2聚类分析

采用NTSYS-PC软件对这些扩增条带进行遗传差异的统计学分析，其相似系数结果见表4，聚类分析结果见图2。

从表4可以看出，25份供试材料的相似系数变化范围在0.275 8-0.931 0之间。白木通和三叶木通的相似系数在0.517 2～0.758 6之间，均值为0.637 9：白木通和五叶木通的相似系数在0.275 8-0.620 6之间，均值为0.448 2：而三叶木通和五叶木通的相似系数在0.310 3-0.689 6之间，均值为0.500 0。由相似系数可以看出，三叶木通和白木通的遗传相似系数最大，二者亲缘关系较近：白木通与五叶木通的遗传相似系数最小，二者亲缘关系较远。

从图2可以看出，根据SRAP标记得到25份材料的聚类结果显示，在相似系数0.45处可将参试材料分为2类，白木通和三叶木通聚为一类，五叶木通聚为一类：白木通与三叶木通聚为一类后，最终和五叶木通聚为一类。大部分来自相同或相似生态地理环境的能聚为一类，表现地域相似性，如来自庐山的白木通聚为一类（C2、C3），来自井冈山的白木通聚为一类（c4、v5），来自南昌梅岭的三叶木通聚为一类（V8、V9、V10和V11、V12、V14、），三清山的聚为一类（V16、V17），云居山的聚为一类（V18、V19）。

3.小结

试验采用12对SRAP标记引物对25个木通属植物样品基因组DNA进行扩增，得到清晰条带208条，多态性条带173条，多态性比率为83.2%，表明SRAP技术对木通属植物的扩增具有较高的效率，适于其种质遗传变异检测，是一种有效、可靠的分子标记，将为进一步开展木通属种质资源的鉴定及其良种选育工作奠定基础。

聚类分析结果表明，3种木通属植物有明显的界限，白木通聚为一类，三叶木通聚为一类，五叶木通聚为一类，白木通与三叶木通聚为一类后，最终和五叶木通聚为一类：此结果与传统分类结果相符。