枣庄石榴根结线虫的鉴定

夏彦飞　乔俊卿　张雪雯　杨列祥

摘要：采用形态鉴定法、同工酶法、PCR法对山东省枣庄市榴园镇石榴园一株枯死石榴树的根结线虫样本进行了鉴定，病原线虫鉴定为南方根结线虫。

关键词：石榴；根结线虫；鉴定

根结线虫是植物寄生线虫中危害重、寄主广泛的一类线虫，目前为止，已经近百种。根结线虫通过2龄幼虫侵入寄主根系维管束后固定取食并发育为成虫，线虫在发育过程中干扰寄主植物的正常生理过程，导致寄主植物呈现特异性的根结病害症状。石榴树是一种原产自西域的果树，经丝绸之路传至中原，因其树姿优美，花期长，且果实营养丰富，是具有较高经济价值的树种之一。山东省枣庄市是中国重要的石榴产区之一，随着石榴树龄的增长、树势的衰弱及病虫的侵害，常常导致严重减产甚至树木死亡，这一问题已成为枣庄石榴产业发展和农民增收的重要障碍。根结线虫病是石榴树常见病害之一，由于其破坏根系影响养分的疏导，特别是对树龄较高的石榴树危害更大。已报道危害石榴树的根结线虫有多个种，山东枣庄地区根结线虫种类尚不明确。本研究通过会阴花纹特征，采用形态鉴定法、SCAR-PCR法、同工酶法对山东省枣庄市榴园镇石榴园一株枯萎石榴树的根结线虫样本进行种类鉴定。

1.材料与方法

1.1雌虫会阴花纹的形态观察

用挑针挑取枣庄市榴园镇石榴园枯萎石榴植株根结中的雌性成虫，放在含有45%乳酸溶解液的载玻片上，在解剖镜下用解剖刀切取虫体的会阴部角质膜，轻轻剔除内含物，清洗干净后，将角质膜置于甘油中制成永久玻片，显微镜下观察会阴花纹特征。

1.2SCAR-PCR分析

SCAR-PCR扩增所用的特异性引物参考Dong等和Meng等（表1），引物由南京金斯瑞生物科技有限公司提供。PCR反应所用的试剂购买于大连宝生生物公司。

将挑出的石榴根结单卵块清洗干净后放入含有无菌水的凹面皿中，置于26℃恒温培养箱中分离根结线虫2龄幼虫待用。以已知的花生根结线虫MA、南方根结线虫（Meloidogyne incognita）MI、北方根结线虫MH、爪哇根结线虫MJ4种线虫的DNA作为对照。

为了保证鉴定结果的准确性，PCR反应所用的DNA模板为单条线虫的DNA样品。单条线虫的DNA提取参考Wang等、王江岭等的方法。单条线虫挑入含有8 μL无菌水的洁净凹皿中，在解剖镜下用挑针把线虫切成2-3段：然后把含有线虫的裂解液转移到200 μL的PCR管中，放入液氮中处理5 min，置于65℃水浴3 min（重复2-3次）：PCR管中加入2 μL的5×裂解缓冲液（10xEx Taq PCR Buffer 100 μL，10μg/L蛋白酶K 10μL，ddH₂O 90μL），65℃加热1 h，95℃加热10min，得到DNA。提取液进行PCR扩增。

1.3同工酶分析

酯酶、苹果酸脱氢酶操作步骤参照Esbenshade等的研究方法，对从供试样本中挑出的成熟雌虫进行同工酶电泳分析。以实验室保存的番茄南方根结线虫种群作为对照组。

2.结果与分析

2.1雌虫会阴花纹形态的观察

供试石榴根结线虫雌成虫会阴花纹线纹紧密、波浪状，呈椭圆或近圆形，无明显的侧线，背弓较高，背弓顶部圆或平（图1）。根据刘维志的描述，供试根结线虫样本属于南方根结线虫。

2.2 SCAR-PCR电泳检测结果

由图2可知，所用的4对根结线虫特异性引物只有南方根结线虫的特异性引物（MI）从供试样本中扩增出955 bp的条带（泳道1），和对照泳道2扩增的条带一致，其余的三对特异性引物（MH、MA、MJ）没能从供试样本（泳道3、5、7）中扩增出特异性条带，设置的对照组（泳道4、6、8）都能扩增出相应的特异性条带（1 500、950、517 bp），结果表明，此枯萎石榴树根结线虫病害的病原物为南方根结线虫。

2.3同工酶鉴定

供试根结线虫的酯酶（Est）一条主带，电泳相对迁移率（Rm）约0.47，为II型；苹果酸脱氢酶（Mdh）为单条酶带，Rm约0.23，为N1型。苹果酸脱氢酶和酯酶的同工酶谱型与对照线虫南方根结线虫的谱型完全相同（图3）。

3.小结与讨论

目前，在中国危害的根结线虫类群有39种，其中南方根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、爪哇根结线虫4种根结线虫造成的损失占90%以上。准确鉴定根结线虫的类群是开展线虫病害防治及其相关研究的基础，形态鉴定法、同工酶谱法、细胞遗传学、分子生物学等是根结线虫种类鉴定的常用方法。形态鉴定法操作方便简单，但是种内及种间存在变异，鉴定结果存在一定的不确定性。同工酶谱鉴定法仅对发育成熟的雌虫进行鉴定，但其可靠性高，在根结线虫常规种类鉴定中经常使用。基于PCR技术的分子生物学鉴定法准确可靠、检测灵敏，适用于线虫各发育阶段，是近年来发展较快的根结线虫鉴定方法。为了避免单一方法鉴定线虫存在的不可靠性，本研究分别采用形态鉴定法、同工酶谱法、SCAR-PCR法对枣庄市榴园镇石榴园的根结线虫种类进行研究，结果表明，3种方法都鉴定其为南方根结线虫。周银丽等对危害云南石榴的根结线虫种群鉴定为南方根结线虫、北方根结线虫和花生根结线虫。本研究中采集的样本经鉴定均为南方根结线虫，在本地区是否有其他根结线虫种危害石榴，仍需要在今后的研究中进一步扩大采样的范围。