接种物添加量对紫花苜蓿常温厌氧发酵的影响

张莉娟　张无敌　尹芳　赵兴玲　王昌梅　柳静　杨红　刘士清

摘要：以紫花苜蓿（Medicago sativa）为原料，分别加入30%、40%、50%的接种物，在常温下（20～22℃）、总固体（TS）含量为6%（以30%接种量计算）的条件下进行厌氧发酵，考察接种量对紫花苜蓿发酵的日产气量、pH、产气速率的影响。结果表明，接种量为40%时的产气效果良好，总产气量为3 625 mL，比接种量为30%的试验组高8.05%，略低于接种量为50%的试验组。试验初期，pH出现一定下降，但很快又恢复至合适水平，整个阶段pH比较稳定。综合考虑，对于紫花苜蓿发酵，40%的接种量较优。

关键词：紫花苜蓿（Medicago sativa）；常温厌氧发酵；接种物；接种量；产气潜力

紫花苜蓿（Medicago sativa）简称苜蓿，是豆科苜蓿属多年生草本植物，是世界上分布最广的豆科牧草，也是中国种植面积最大的人工牧草，达到210万hm²，在世界苜蓿生产大国中占第5位。紫花苜蓿作为品质优、产量高、适口性好的牧草饲料为全球畜牧业做出重大贡献，并且长期种植苜蓿有改良土壤的作用，因此紫花苜蓿在中国生态建设中也有重要作用。随着生物技术的快速发展，人们对紫花苜蓿的传统利用从优质牧草扩展到其他方面，其中以苜蓿作为生物反应器来生产疫苗、工业酶制剂和工业可降解塑料以及一些重要的药用蛋白等研究已经取得了很大进展。

前期探究了紫花苜蓿中温条件下厌氧发酵的产气潜力，为进一步实现紫花苜蓿资源化利用，提高其能源转化效率，本研究欲摸索在实验室水平上接种物浓度对紫花苜蓿反应启动、产气量及产气速率的影响。通过选择适宜的接种物浓度，以期达到启动平稳、产气速率快、产气量多的效果，从而缩短反应周期，节省成本，增加经济效益，为紫花苜蓿能源转化效率提高提供理论依据。

1.材料与方法

1.1材料

发酵原料为紫花苜蓿，采自云南师范大学校园，经测定总固体（TS）含量为92.29%，挥发性固体（VS）含量为90.64%。接种物为实验室发酵后的底泥，经测定TS含量为10.75%，VS含量为55.57%。

1.2试验装置

采用实验室自制的500 mL的批量式发酵装置，装置示意图如图1所示。

1.3方法

1.3.1原料预处理 将紫花苜蓿清理后切碎成长度小于2 cm的小段，以便其与接种物充分混合均匀。

1.3.2试验设计 设置A、B、C 3个不同接种量试验组，其接种量分别为30%、40%、50%，每组分别设3个平行，发酵液TS按6%配制（以30%接种量计算）。为保证试验的一致性，进行单瓶配料。具体配比见表1。为了提高试验的精确度，设置3个空白组作为对照，在试验结束后计算其总产气量，并用各组的总产气量减去相应值作为最终产气量。采用常温厌氧发酵，每天定时记录温度变化、产气量、pH及火焰颜色。

1.3.3测试项目及方法 ①产气量。采用排水集气法测定，每天定时记录各组的产气量，以各组3个平行的平均产气量作为各组的表征产气量。同时采用火焰颜色比色卡法，根据火焰颜色来判断气体中的甲烷含量。②TS、VS含量。采用常规分析法测定原料接种物以及发酵前后料液的TS、VS。TS：在（105±5）℃的电热恒温干燥箱（202型）中烘干至恒重，利用TS计算公式求出TS；VS：在（550±20）℃箱形电阻炉（SX2-2.5-12型）中灼烧至恒重，利用VS计算公式求出VS。③pH。采用pH 6.4～8.0的精密pH试纸测定。

2.结果与分析

发酵温度在20-22℃变化，统计了A、B、C 3个组日产气量，对产气速率进行计算，分别对发酵液前后的TS、VS、pH进行测定，最后分析接种物用量在紫花苜蓿发酵中的影响。

2.1接种量对紫花苜蓿发酵产气量的影响

空白对照组厌氧发酵的产气量极少，表明接种物中可被微生物利用的有机物很少，仅能起到一个提供生产者的作用，其自身产气量对试验的影响可忽略。发酵过程中A、B、C 3个组的日产气量和产气速率变化如图2所示。由图2可以看出，接种物浓度的不同对厌氧发酵产沼气的影响很大。在试验开始后，接种量最大的C组启动速度最快，B组次之，A、B、C 3个组在整个试验阶段均出现了2个产气高峰。其中，C组在发酵10 d时出现第1个产气高峰，为360 mL，甲烷含量约为60%：B组和A组分别在15 d和20 d时出现了第1个产气高峰，分别为320、300 mL，B组甲烷含量约为65%，A组约为55%。C组在19 d时出现第2个产气高峰，为200mL；B组和A组的第2个产气高峰分别在28 d和34 d，峰值分别为140、180 mL。

在厌氧发酵初期，反应器中尚未形成严格的厌氧环境，抑制了其产甲烷菌的活性。随着反应器内氧气的减少，产酸阶段受到抑制，为产甲烷菌的生长繁殖创造良好的环境，产甲烷菌开始将产酸阶段产生的有机酸转化为CH4，产气速率不断加快。从整个发酵过程来看，在反应前半段，B组、C组产气一直很好，很快达到产气高峰，明显高于A组；但在发酵23 d以后c组产气量低于140 mL，产气量明显下降。可能是由于接种物浓度高，其中含有的产甲烷菌较多，有机物被产甲烷菌快速利用，产气减少。张锡辉在Contois模型中提到，物料浓度一定时，若接种物浓度越大，接种物中微生物的生长速度将下降。经过一段时间的繁殖，产甲烷菌的数量进一步增加，产甲烷菌之间相互竞争造成相互抑制，导致产气量下降，因此，c组的产气量略高于B组。

整个过程中A、B、C 3个组的累积产气量分别为3 355、3 625、3 685 mL，B组和C组的产气量相差不大，但明显大于A组，分别比A组多8.05%和9.84%。c组在27 d时产气速率达80%以上，B组、A组分别在28 d和31 d时产气速率才达到80%以上。在实际运用中，优先考虑B组、C组，这样缩短水力滞留时间，节省成本。

2.2接种量对料液pH的影响

接种物浓度对反应物料液oH的影响如表2所示。在料液发酵前，料液pH分别为7.0、7.0、7.2，均在厌氧发酵的最适范围内。厌氧发酵5 d时，A组的pH降到5.5，B、C组分别降至6.0、6.5，中间有5 d出现酸化现象。发酵8 d后，通过自身调节，pH不断升高，并恢复至合适的pH范围。8～20 d pH基本没有发生变化，20 d时A、B、C组pH分别为6.7、7.0、7.0.20-30 d基本没有变化，发酵后料液pH都是7.0，总体来讲除了酸化期，pH的变化很小，在正常范围内波动。

2.3接种量对TS、VS及原料产气率的影响

不同浓度接种物的各试验组，其原料产气率、TS产气率及VS产气率如表3所示。由表3可以看出，C组的原料产气率、TS产气率及VS产气率均高于A、B组，B、C组（B组为327 mL/g，C组为333mL/g）的TS产气率明显高于A组（302 mL/g），B、C两个组之间差距较小。从火焰颜色来看，发酵过程中B组甲烷含量最高，并且发酵稳定。

3.结论

目前研究接种物主要集中在接种物的种类来源和浓度对厌氧发酵的影响。Suwannoppadd等采用发酵牛粪、消化污泥、草炭作为接种物对青草进行降解，并且比较快速高温发酵启动时的区别，结果表明消化污泥要比发酵牛粪、草炭效率高。潘云霞等研究不同接种物浓度对牛粪发酵反应启动、产气量及产气速率的影响，接种物浓度6%、物料与接种物浓度为1：1情况下，结果表现最好。秸秆厌氧发酵需要对接种物种类、接种比进行研究，以此提高原料产气率、甲烷含量，缩短发酵周期。

本研究结果表明，接种物是影响发酵的因素之一，而接种量同样会影响发酵整体情况。适当的增大接种量能够提高厌氧发酵的启动速度，增强发酵体系的抗酸化缓冲能力：但当接种量过大时，由于产甲烷菌的相互竞争造成了相互抑制，原料产气率会达到一定极限，并且所产气体甲烷含量出现一定程度的降低。综合各方面考虑，在紫花苜蓿厌氧发酵中，接种量以40%最佳，其TS产气率为327 mL/g，VS产气率为361 mL/g。