TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用

李涛 万译文 刘登望

摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA，利用针对锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，经反应体系优化，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。整个过程快速、简捷，操作简单，可对KHV进行快速有效的诊断，具有一定的应用价值。

关键词：锦鲤疱疹病毒；荧光定量PCR；TaqMan；一步法

中图分类号：S941.41+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）07-0125-04

锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一种传染性疾病。KHV能够感染锦鲤、鲤鱼和剃刀鱼，其鱼苗、幼鱼、成鱼均可感染。锦鲤疱疹病毒病多发于春、秋季，潜伏期两周左右，鱼发病并出现症状24～48 h后开始死亡，2～4 d内死亡率可迅速达到80%～100%[1，2]。此病首先在以色列暴发，接着美国、欧洲（如英国、德国、比利时）及亚洲一些国家均有此病发生，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[3，4]。

锦鲤疱疹病毒颗粒呈球状，有囊膜，直径约170～230 nm，其核衣壳为对称十面体，直径为100～110 nm，该病毒由31种病毒多肽组成，遗传物质为双链DNA，基因组大小约为277 kb[5，6]。

目前锦鲤疱疹病毒病的检测方法有电镜检测、ELISA、普通PCR和荧光定量PCR等[7]。TaqMan荧光定量PCR是在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性荧光探针，该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[8～11]。

鉴于锦鲤疱疹病毒病对养殖业带来的危害，对其进行快速准确的检测具有重要意义。本研究通过比对两种不同的核酸提取方法，建立了基于TaqMan荧光定量PCR技术快速检测KHV的方法，以期为有效控制锦鲤疱疹病毒病的传播提供技术支持。

1材料与方法

1.1病毒株

KHV标准毒株VR1592购自北京中原公司。锦鲤细胞系（KF）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）和鲤鱼疱疹病毒（CHV）核酸由湖南水产科学研究所馈赠。

1.2主要仪器和试剂

荧光定量PCR仪购自上海宏石医疗科技有限公司；通用一步法DNA提取液、柱式病毒基因组抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司（简称上海生工）；脱氧三磷酸核苷酸（dNTPs）、Taq DNA聚合酶购自普洛麦格生物技术有限公司（北京）；三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯化钾（KCl）、氯化镁（MgCl2）、硫酸铵、甘油等购自西陇化工有限公司（广州）。

1.3引物设计

查找KHV相关基因并利用ClustalX2进行序列比对，最后选定TK基因的保守区设计引物和探针，使用引物设计软件Oligo7。正向引物F1：5′-GCTGGAGCGTCTGTCCT-3′；反向引物F2：5′-ATGGCCACCTTGGACTCTT-3′；TaqMan探针：FAM-5′-ACGCTGCATCGCCGTCAAGCAC-3′-BQ1，扩增长度为90 bp。经NCBI网站上的Primer-Blast分析本套引物具有KHV特异性。同时以KHV全长基因组序列（KJ627438）为模板合成含TK基因的质粒做为参考品。引物、探针及质粒皆由上海生工合成。

1.4TaqMan荧光定量PCR反应体系的优化

PCR反应体系（50 μL）包括Tris-HCl （pH 8.0） 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，dNTPs 30 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，Taq酶10 U，添加（NH4）2SO4 10 mmol/L和甘油3%增加扩增的特异性和稳定性。

引物和探针终浓度的筛选：利用0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μmol/L的引物终浓度和0.03、0.06、0.12、0.24、0.48 μmol/L的探针终浓度对样品进行扩增，筛选引物和探针的最佳浓度。

扩增程序如下：95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，共40个循环，收集荧光信号；4℃保温。

1.5病毒培养

将KHV 标准毒株VR1592 接种KF 细胞，待出现细胞病变收获病毒培养液（以下简称细胞毒）。

1.6DNA提取方法比较

KHV DNA分别用两种试剂盒提取并进行对比。

方法一：一步法，利用通用一步法DNA提取液。将约2 μL液体样品或固体组织研磨液（剪取约20 mg锦鲤腮腺组织，加入200 μL生理盐水，用玻璃匀浆器充分研磨得到组织研磨液）加入到50 μL提取液中，80℃加热5 min后，简短振荡混匀后取裂解物直接进行PCR。

方法二：柱提法，利用柱式病毒基因组抽提试剂盒。按照试剂盒说明书操作，经过蛋白酶K裂解、吸附柱收集、DNA洗脱等步骤，大约需要1 h。

1.7特异性试验

应用建立的荧光定量PCR方法同时对锦鲤疱疹病毒（KHV）、鲤春病毒血症病毒（SVCV）、传染性造血器官坏死病毒（IHNV）、病毒性出血性败血症病毒（VHSV）和鲤鱼疱疹病毒（CHV） DNA进行扩增，检测KHV引物和探针的特异性。

1.8敏感性试验

KHV质粒由上海生工合成后，然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数：每微升质粒拷贝数=（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA序列长度×660）。将质粒进行10 倍梯度稀释，检测该方法的敏感性。

1.9重复性试验

取3个批次细胞毒样本，用一步法提取DNA后进行荧光定量PCR检测。同一样本做3个平行检测。

1.10样品检测

应用建立的荧光定量PCR方法将30 份细胞培养物与攻毒鱼组织样本进行检测，同时利用普通PCR进行检测，比较荧光定量PCR方法的应用情况。

2结果与分析

2.1PCR反应体系的建立

最终确定引物、探针终浓度分别为0.1、0.06 μmol/L时能获得较理想的扩增结果，浓度增加扩增效果提高不明显，浓度降低则荧光信号较低。

最终的PCR反应体系（50 μL）：Tris-HCl （pH 8.0） 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，（NH4）2SO4 10 mmol/L，甘油3%，dNTPs 30 mmol/L，MgCl2 5 mmol/L，Taq酶10 U，正、反向引物各0.1 μmol/L，荧光探针0.06 μmol/L。

2.2两种DNA提取方法比较

对同一细胞毒运用两种方法提取DNA，并用荧光定量PCR方法重复检测3次。结果显示两种方法无明显差异（图1，表1），说明一步法可以提取代柱提法进行KHV DNA提取并进行荧光PCR检测。

2.3特异性试验结果

应用建立的荧光定量PCR方法同时检测KHV、SVCV、IHNV、VHSV和CHV DNA，只有KHV有扩增曲线（图2），说明该方法具有良好的特异性。

2.4敏感性试验结果

将KHV质粒进行10倍梯度稀释，共4个梯度，分别为3×104、3×103、3×102、3×10 拷贝/μL，最低检测限为30 拷贝/μL（图3）。以质粒浓度30 拷贝/μL为模板进行20次重复检测，检出率为95%，证明该方法检测KHV具有极高的灵敏度。

2.5重复性试验结果

3个批次细胞毒样本用一步法分别提取DNA后均分3次进行荧光PCR扩增，结果（图4，表2）显示该方法重复性较好，变异系数CV<2.00%。

2.6临床样品检测结果

采用建立的一步DNA提取法结合荧光定量PCR方法检测30份细胞培养物与攻毒鱼组织样本（表3），荧光定量PCR阳性检出率为96.67%（29/30），普通PCR阳性检出率为60%（18/30）。两种方法比较，荧光定量PCR方法检测KHV具有更高的灵敏度。

3讨论与结论

荧光定量PCR利用荧光信号的变化实时监测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，简化了检测过程，重复性好、灵敏度高、特异性强、结果清晰，具有广泛用途[8～11]。

在其它利用荧光定量PCR方法检测锦鲤疱疹病毒的研究中，DNA提取方法大多采用商业试剂盒柱提法[3， 6]或经典CTAB法[12]。柱提法步骤繁多，耗时长；而经典CTAB法所用有机试剂酚、氯仿等可造成环境污染，对人体危害大。本研究选用的一步法，整个提取过程不包含去蛋白、去RNA及其它次生代谢物的过程，无需有机溶剂抽提，无需无水乙醇沉淀，简便、快捷，操作简单，只用一步（约5～10 min）即可得到用于 PCR 扩增的 DNA模板，且质量稳定可靠。结合优化的PCR反应体系，可对锦鲤疱疹病毒进行快速有效诊断，具有一定应用价值。

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