胚胎培养液氨基酸浓度与拉曼光谱特征对IVF—ET妊娠结局的影响研究

谭小方 金华 徐丽 施蔚虹 李海波 丁家怡

摘要：目的 探讨胚胎培养液氨基酸浓度与拉曼光谱特征对IVF-ET妊娠结局的影响表现。方法 选取163对行IVF-ET助孕的夫妇，按照是否妊娠分为移植妊娠组和移植未妊娠组，收集胚胎培养液检测氨基酸代谢水平，行拉曼光谱分析。结果 移植妊娠组天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均低于移植未妊娠组，丙氨酸-谷氨酰胺水平高于后者（P<0.05）；移植妊娠组胚胎培养液拉曼光谱信号与移植未妊娠组相比明显增强（P<0.05）。结论 天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺水平和拉曼光谱特征对胚胎移植后的妊娠结局有一定的影响。

关键词：胚胎培养液；氨基酸浓度；拉曼光谱特征；IVF-ET妊娠结局；影响

随着氨基酸代谢及光谱技术研究的不断深入，人们逐渐发现氨基酸代谢水平、拉曼光谱与胚胎发育潜能之间有一定的关联，可以作为检测胚胎质量的辅助方法[1]。本文探讨了胚胎培养液氨基酸浓度与拉曼光谱特征对IVF-ET妊娠结局的具体影响。

1 资料与方法

1.1一般资料 资料来源于2013年于南通妇幼保健院生殖医学中心行IVF-ET助孕的163对不孕夫妇的临床资料，在患者知情同意的原则和医院生殖医学伦理委员审议批准下，符合以下条件：①女方年龄≤35岁；②夫妻双方无确诊的染色体异常；③非反复种植失败者（既往连续种植失败的周期数﹤3）；④女方无宫腔镜确诊的宫腔畸形、粘膜下子宫肌瘤或子宫内膜息肉；⑤女方无腹腔镜或B超诊断的子宫内膜异位症或子宫腺肌病；⑥女方无确诊的多囊卵巢综合征（PCOS）；⑦促排卵过程中B超下未见明显的输卵管积液或宫腔积液；⑧人绒毛膜促性腺激素（HCG）注射日内膜厚度≥8mm，B超下内膜无明显异常回声光团。按照移植胚胎是否妊娠分为移植妊娠组和移植未妊娠组，移植妊娠组81例，年龄25～34岁，移植未妊娠组82例，年龄24～35岁。

1.2方法

1.2.1胚胎培养 ①收集胚胎培养液：收集不同卵裂阶段的胚胎培养液，以其体外培养的胚胎及培养液为研究对象，结合胚胎形态学评分系统，原核期评分采用Scott评分法，卵裂期胚胎评分及分级采用Gardner评分法。分别收集原核期、二细胞期、四细胞期、八细胞期、囊胚期胚胎培养液；②保存胚胎培养液：在经形态学评估后，移出胚胎后，收集原核期、二细胞期、四细胞期、八细胞期、囊胚期胚胎培养液，于-80℃冰箱保存，待测。

1.2.2氨基酸成分分析 取胚胎培养液10μL，用流动相10倍稀释，用HPLC法分析20种游离氨基酸浓度。HPLC条件：C18反相色谱柱，4.0×125mm，粒径5μm；流动相A：10mmol/L Na2HPO4+pH 7.2 PBS缓冲液，流动相：PBS+甲醇+乙腈（体积比50：35：15）；梯度洗脱：在0～20min内，流动相B以线性从0上升至100%；流速1.0ml/min；株温：40℃；激发波长340nm，检测波长450nm。

1.2.3拉曼光谱分析 冷冻的胚胎培养液室温解冻后放置30 min以使标本恒温，毛细管吸取5μL标本，置于拉曼显微镜下进行拉曼光谱分析。实验条件：激发光：氩离子激光器，激发波长514.5nm，激光输出功率20mW，CCD检测器，曝光时间20～60s，测量范围：50～4000cm-1。

1.3统计学方法 采用SPSS软件包进行统计学分析。数据描述采用（x±s），两组定量资料比较采用t检验或秩和检验；单因素和多因素Logistic回归分析氨基酸浓度与IVF妊娠结果的关系；P<0.05为差异有统计学意义。根据临床随访妊娠结局，分析妊娠组和非妊娠组不同阶段胚胎培养液的光谱，及各胚胎期培养液氨基酸浓度分析，筛选出与妊娠相关的代谢成分指标。

2 结果

2.1移植妊娠组和移植未妊娠组胚胎培养液中氨基酸水平对比 对比移植妊娠组和移植未妊娠组的10种氨基酸水平发现，移植妊娠组中天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸水平均低于移植未妊娠组，而且丙氨酸-谷氨酰胺水平高于后者，P<0.05，有统计学意义。见表1。

2.2氨基酸水平对IVF-ET妊娠结局影响的回归分析结果

Logistic回归分析显示IVF-ET妊娠结局与谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺呈负相关。见表2。

2.3移植妊娠组和移植未妊娠组胚胎培养液拉曼光谱对比 移植妊娠组胚胎培养液拉曼光谱信号与移植未妊娠组相比明显增强，P<0.05，有统计学意义。见图1。

3 讨论

IVF-ET自世界上首例试管婴儿诞生以来便引起了全社会的广泛关注，人类整体妊娠率也有所提高，但是IVF-ET妊娠成功率仍然不足30%，严重影响IVF-ET技术的临床推广[2]。研究发现，影响IVF-ET妊娠结局的因素是多方面的，虽然多个胚胎移植能够显著提高妊娠成功率，但是其所导致的产科并发症也较多[3]。

本次研究结果显示天冬氨酸、谷氨酰胺、丙氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺水平和拉曼光谱特征对妊娠结局都有一定的影响。可见，上述氨基酸代谢水平在一定程度上反映了胚胎的发育潜能，而且分析胚胎培养液的拉曼信号强度有助于提升胚胎质量评估的准确性。

参考文献：

[1]邓彬，李予，王文军，等.胚胎培养液氨基酸浓度与体外受精-胚胎移植妊娠结局的关系[J].中山大学学报（医学科学版），2013，34（6）：900.

[2]易艳红，董梅，陈创奇，等.胚胎培养液中氨基酸浓度对选择性单胚胎移植妊娠结局的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志，2014，28（12）：1163-1165.

[3]谭小方，金华，徐丽，等.IVF-ET周期中胚胎培养基的氨基酸代谢水平与妊娠结局的相关性研究[J].生殖医学杂志，2015，24（3）：186-190.

编辑/周芸霏