胡桃楸种仁壳黄酮二次纯化及体外抗氧化作用研究

徐红艳　包怡红

摘要：利用HPD600大孔树脂二次纯化胡桃桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）种仁壳黄酮，并分析二次纯化黄酮的体外抗氧化作用。结果表明，纯化后黄酮纯度进一步提高到54.39%，二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮表现出较好的清除ABTS、DPPH、羟自由基的能力和明显的脂质过氧化抑制作用，IC₅₀值分别为9.52μg/mL，1.273、1.479、1.678mg/mL，呈现剂量一效应关系，且脂质过氧化抑制作用优于维生素C，可进一步开发成食品添加剂或功能性食品。

关键词：胡桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）；种仁壳；黄酮；抗氧化作用

中图分类号：TS255.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）09-2339-05

自由基是指含有孤立、不成对价电子的原子或原子基团。生物体在自然的新陈代谢过程中，会产生如超氧阴离子自由基（O₂^-·）、羟自由基（·OH）和过氧化氢（H₂O₂）等活性氧自由基。研究表明，哺乳动物的机体具有某些抵抗和减少氧化损伤的防御机制，但是由于活性氧自由基的高度活化，能够破坏脂类、蛋白质、酶类、DNA以及RNA等，所以当这些活性氧自由基过量产生而又不能被及时清除时，就会对机体造成极大的损害，甚至引发疾病。抗氧化物具有还原性，在反应过程中由于提供基团和氢原子而自身被氧化，因此发挥着自由基清除和氧化反应链阻断的作用，流行病学调查也显示含有抗氧化特性食物的摄入，特别是黄酮类和其他多酚化合物可提高机体的抗氧化功能，对人类的健康十分有益。

胡桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）已在民间和传统医药中用于治疗多种疾病，现代研究表明，胡桃楸具有抗氧化、镇痛抗炎、抗肿瘤、抗HIV等广泛的生物活性。胡桃楸种子是林业副产品，其种仁（俗称山核桃仁）营养价值很高。早已成为人们的食疗佳品。在种仁生产过程中，产生大量的种仁壳废弃物被丢弃，造成了资源的浪费。黄酮是具有酚羟基的一类还原性化合物，研究表明，黄酮具有抗氧化、保护心血管系统、抗肿瘤等多种生物活性。目前，关于胡桃楸种仁壳黄酮的体外抗氧化作用研究鲜见报道。

本研究是在前期胡桃楸种仁壳黄酮的提取工艺优化、大孔树脂纯化条件选择的基础上。进行二次纯化。并通过建立ABTS、DPPH、羟自由基和脂质过氧化等不同的氧化反应体系，分析二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮的体外抗氧化作用，为胡桃楸种仁壳黄酮后续生物活性的深入研究奠定基础，为实现废弃胡桃楸种仁壳的综合利用和提高胡桃楸种子的附加值提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡桃楸种仁壳一次纯化黄酮：采用超声波辅助提取。HPD-600大孔树脂纯化。45℃减压浓缩，4℃保存。DPPH、ABTS、大豆卵磷脂（Phosphatidvl-choline）、二甲基亚砜（DMSO），购于Sigma公司；Trolox，购于Merck公司：维生素C，国药集团化学试剂有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2仪器

G560E型旋涡混合器，美国Scientificindustries公司：5804R型离心机，德国Eppendorf公司：UV-2450型紫外分光光度计，日本岛津公司：InfinireM200PRO型全波长酶标仪，瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 胡桃楸种仁壳黄酮二次纯化 将胡桃楸种仁壳黄酮一次纯化液调成质量浓度为1.2mg/mL的溶液，动态上样，控制流速1mL/min。先用4BV的蒸馏水洗树脂柱，然后用40%乙醇溶液洗脱，控制洗脱流速2mL/min，洗脱液分段收集：再用60%的乙醇溶液洗脱，洗脱液分段收集，测定每份洗脱液中黄酮的浓度，计算黄酮回收率。

1.3.2 黄酮纯度测定 称取纯化后各段产品冻干粉溶于60%乙醇溶液中，采用NaNO₂-A1（NO₃）₃比色法测定溶液的黄酮浓度，按公式（1）计算纯度，并进行比较。

（1）

式中，C为黄酮质量浓度（mg/mL），N为稀释倍数，y为样品液体积（mL），m为样品质量（mg）。

1.3.3 总还原力测定 测定大孔树脂纯化后各段产品的总还原力，并进行比较。采用铁氰化钾还原法，在试管中加入提取液2mL，再分别加入pH6.6的磷酸缓冲液2.5mL、1%铁氰化钾2.5mL，混匀后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷却，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混匀，4000r/min离心10min。取上清液2.5mL。加入2.5mL蒸馏水，再加入0.5mL三氯化铁显色，静置10min，700nm波长处测定其吸光度A₁。以蒸馏水代替提取液的吸光度为A₀。Fe³⁺总还原力=A₁-A₀，A₁-A₀越大说明Fe³⁺总还原力越强。

1.3.4 二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮体外抗氧化作用

1）清除ABTS自由基

参照Kim等的方法并略有改进。2.6mmol/L过硫酸钾溶液与7.4mmol/LABTS溶液等体积混合，室温避光静置24h后为ABTS储备液，4℃避光储存。用时稀释成ABTS工作液，使其在734nm波长下吸光度为0.700±0.020。取ABTS工作液2.85mL，加入胡桃楸种仁壳黄酮样品液0.15mL，室温避光10min，734nm波长下测A₁，以蒸馏水代替ABTS工作液的吸光度为A₂，以甲醇代替样品液的吸光度为A₀。按公式（2）计算清除率：

（2）

2）清除DPPH自由基

参照Gtilsen等的方法并略有修改。0.15mmol/LDPPH储备液，4℃避光储存。用时稀释成DPPH工作液，使其在517nm波长下吸光度为0.700±0.020。取DPPH工作液100μL，加入胡桃楸种仁壳黄酮样品液100μL，室温避光30min，517nm波长下测定A₁，以无水乙醇代替DPPH工作液的吸光度为A₂，以无水乙醇代替样品液的吸光度为A₀。按公式（2）计算清除率。

3）清除羟自由基（·OH）

采用Fenton反应产生羟基自由基（·OH）。羟基自由基氧化水杨酸产生的2，3-二羟基苯甲酸，其在510nm处有特征吸收。从而可以通过检测反应体系中2，3-二羟基苯甲酸的生成量，检测残留的羟自由基，进而测定胡桃楸种仁壳黄酮对羟基自由基的清除作用。

取6mmol/L的FeSO₄，7H₂O溶液1mL，加入6mmol/L的H₂O，溶液1mL，立即混匀，加入1mL胡桃楸种仁壳黄酮样品液，混匀。静置10min。再加入6mmol/L的水杨酸钠溶液1mL，37℃水浴30min，4000r/min离心10min，取上清液510nm波长处测定吸光度A₁，蒸馏水代替水杨酸钠溶液的吸光度为A₂，蒸馏水代替样品液的吸光度为A₀。按公式（2）计算清除率。

4）对脂质过氧化的抑制作用 胡桃楸种仁壳黄酮对脂质过氧化的抑制作用通过对反应体系中丙二醛的减少量进行衡量。参照Huang等的方法并略有修改，用0.1mol/L的PBS配制1%的大豆卵磷脂溶液。取0.5mL卵磷脂溶液加入6mmol/L的FeSO₄·7H₂O溶液0.2mL和100mmol/L的H₂O₂溶液0.1mL。再加入1mL不同浓度的黄酮样品溶液，混合物于37℃水浴60min，加入15%的三氯乙酸溶液1mL，再加入0.8%的硫代巴比妥酸溶液1mL，于沸水浴中15min，然后迅速冷却，5000r/min离心10min，取上清液532nm波长下测定吸光度A₁。蒸馏水代替卵磷脂溶液的吸光度为A₂，蒸馏水代替黄酮样品液的吸光度为A₀，按公式（2）计算清除率。

1.4 曲线拟合

采用CurveExpert1.3软件进行曲线拟合。

2 结果与分析

2.1 二次纯化解吸曲线

将胡桃楸种仁壳黄酮一次纯化液动态上样，控制洗脱流速2mL/min，40%乙醇溶液洗脱，洗脱液共收集9份（图1中1～9号），每份100mL：60%乙醇溶液洗脱，洗脱液每100mL收集1份，共收集9份（图1中10～18号），测定每份洗脱液黄酮浓度，结果如图1所示。40%乙醇洗脱初期，洗脱液中只有极少部分黄酮成分，之后随洗脱剂体积的增加，洗脱液中黄酮含量迅速增加，在第二管时。黄酮含量达到最大值，之后洗脱液中黄酮含量迅速下降。更换洗脱剂为60%乙醇后，洗脱流份中黄酮含量虽有少量增加，但含量仍然很低，并且随着洗脱剂用量的增加，洗脱流份中黄酮含量迅速下降。经测定，40%乙醇洗脱流份的黄酮回收率已达到上样黄酮量的85.9%。表明二次纯化使用40%乙醇为洗脱剂，即可将大部分吸附在树脂上的黄酮洗脱下来。而且动态解吸曲线的峰形窄而高，能达到充分富集黄酮的目的，这样有利于集中收集洗脱下来的黄酮成分。并能节约洗脱剂。因此，确定二次纯化的洗脱剂为40%乙醇溶液。

2.2 二次纯化效果分析

将各段馏份减压浓缩，真空冷冻干燥。各段产品于60%乙醇溶液复溶后，测定各段产品的纯度和Fe³⁺总还原力，结果如图2所示。经大孔树脂二次纯化后。胡桃楸种仁壳黄酮的纯度进一步提高，其中二、三段产品的纯度分别由一次纯化产物的37.7%提高到54.39%和48.45%，因此。选择二次纯化后的二段产品进行后续功能作用研究。

2.3 二次纯化黄酮体外抗氧化作用研究

2.3.1 清除ABTS自由基 胡桃楸种仁壳黄酮对ABTS自由基的清除作用，如图3所示。胡桃楸种仁壳黄酮对ABTS自由基的清除能力随浓度的增加而增强，呈现剂量一效应关系。根据表1中拟合方程，求得50%抑制浓度，IC₅₀值为9.52μg/mL，阳性对照的IC₅₀值为4.14μg/mL，表明胡桃楸种仁壳黄酮对ABTS自由基具有良好的清除作用。

2.3.2 清除DPPH自由基 胡桃楸种仁壳黄酮对DPPH自由基的清除作用，如图4所示。胡桃楸种仁壳黄酮对DPPH自由基的清除作用随浓度的增加而增强，呈现剂量一效应关系。根据表2中拟合方程。求得50%抑制浓度IC₅₀值为1.273mg/mL，阳性对照的，IC₅₀值分别为0.998mg/mL，表明胡桃楸种仁壳黄酮对DPPH自由基具有良好的清除作用。

2.3.3 清除羟自由基 胡桃楸种仁壳黄酮对·OH的清除作用，如图5所示。胡桃楸种仁壳黄酮对·OH的清除作用随浓度的增加而增强，呈现剂量一效应关系。根据表3中拟合方程，求得50%抑制浓度IC₅₀值为1.479mg/mL，阳性对照和维生素C的IC₅₀值分别为0.218、0.208mg/mL，尽管胡桃楸种仁壳黄酮对·OH清除作用弱于对照和维生素C。但当浓度为2.25mg/mL时，清除率达57.86%。表明胡桃楸种仁壳黄酮对，OH具有较好的清除作用。

2.3.4 对脂质过氧化的抑制作用 胡桃楸种仁壳黄酮对脂质过氧化的抑制作用，如图6所示。由图6可知，胡桃楸种仁壳黄酮对脂质过氧化的抑制作用随浓度的增加而增强，呈现剂量一效应关系。根据表4中拟合方程，求得50%抑制浓度，IC₅₀值为1.678mg/mL，阳性对照和维生素C的，IC₅₀值分别为0.696、2.753mg/mL。可见胡桃楸种仁壳黄酮对脂质过氧化的抑制作用小于对照，但明显强于维生素C。表明胡桃楸种仁壳黄酮对脂质过氧化具有显著的抑制作用。

3 小结与讨论

生物活性物质的生理活性功能往往与其抗氧化活性相关，于是抗氧化活性成为天然产物功能研究的首选项目。研究显示，自由基会在机体代谢过程中产生过量的自由基会引发疾病，羟自由基被认为是引发机体衰老和导致疾病最直接的自由基，并认为可以与DNA的嘌呤碱基和嘧啶碱基相互作用，导致硫磺基与氧结合而生成对生物分子具有极大危害的氧硫磺基。过氧化脂质是脂质类氧化的极端反应产物，脂质过氧化被认为是所有生物体系中普遍存在的反应过程，并能对细胞膜和DNA造成损伤。MDA是多不饱和脂肪酸过氧化产生的主要产物，大量研究已将脂质氧化体系中MDA的减少用于衡量天然产物的抗脂质过氧化能力。ABTS自由基常被用于衡量天然产物的总抗氧化能力。DPPH自由基清除能力被广泛用于天然产物抗氧化活性评价中。研究显示，黄酮化合物具有显著的抗氧化作用，可清除自由基并抑制脂质过氧化的发生。本研究中，通过ABTS、DPPH、羟自由基和脂质过氧化等多个氧化反应体系，测定二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮的体外抗氧化作用，结果发现二次纯化黄酮能够有效清除ABTS、DPPH和羟自由基。对脂质过氧化抑制作用优于维生素C，显示出较强的抗氧化作用，良好的抗氧化特性表明胡桃楸种仁壳黄酮可能具有其他生物活性功能，为进一步的深入研究奠定了基础。但胡桃楸种仁壳黄酮体内抗氧化效果有待进一步研究。本研究表明，二次纯化胡桃楸种仁壳黄酮具有良好的清除ABTS、DPPH、羟自由基的能力和显著的脂质过氧化抑制作用，呈现剂量一效应关系，其中脂质过氧化抑制作用优于维生素C。