马铃薯X病毒研究进展

陈虞超　聂峰杰　张丽　巩檑　甘晓燕　石磊　宋玉霞

摘 要：从PVX的发生与分布、基因组结构与功能、检测方法、防治技术和应用研究方面进行了综述，同时对PVX的应用前景进行了展望，旨在为PVX的深入研究提供参考。

关键词：马铃薯X病毒；分布与发生；基因结构与功能；检测方法；防治技术

马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX）又称马铃薯潜隐病毒（Potato latent virus）或马铃薯轻花叶病毒（Potato mild mosaic virus），为马铃薯X病毒属（Potexvirus）模式成员，是由一条正链RNA组成的线性病毒，RNA长约6.4 kbp，病毒粒子呈长杆状，长×宽=515 nm×13 nm。自然条件下主要靠寄主植株不同部位、寄主植株之间接触摩擦进行机械传播。PVX单独侵染时症状较轻，与马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、烟草脉斑驳病毒（Tobacco vein mottling virus，TVMV）、烟草蚀纹病毒（Tobacco etch virus，TEV）等马铃薯Y病毒属病毒复合侵染时症状加剧，造成严重经济损失[1～3]。目前有关PVX的分布与发生、基因组结构和功能、检测方法、防控技术以及生产应用等方面的研究均取得显著进展。本文对上述研究进展进行了综述，探讨其中尚存在的问题，以期为深入开展PVX相关研究提供一定参考。

1 PVX的发生与分布

所有马铃薯（Solanum tuberosum）产区均存在PVX发生的现象，但不同栽培品种受PVX侵染情况存在较大差异，有些品种带毒率较高。在田间，PVX侵染马铃薯植株，引起轻型花叶或者潜隐病征，若多年侵染则易引起重花叶或者植株矮化，造成10%～80%减产。PVX常与PVY复合侵染，使症状加剧[4～6]。PVX主要靠汁液接触传播，也可以由某些昆虫如异黑蝗（Melanoplus differentialis）和绿丛螽斯（Tettigonia viridissima）的咀嚼式口器经机械作用传播，菟丝子（Cuscuta campestris）和集合油壶菌（Synchytium endobiotcum）也能够传播该病毒，但实生种子不能传毒[7]。PVX 寄主范围较广，可侵染16科240种植物，茄科植物是主要的寄主，其诊断寄主有白肋烟（White burley）及其他烟草（Nicotiana tabacum）品种。初侵染的叶片通常表现为坏死斑，之后发展为坏死斑驳、褪绿、花叶或脉褪绿。在曼陀罗（Datura stramonium）上继斑驳之后产生褪绿环，脉褪绿或脉坏死。烟草栽培品种适于作繁殖寄主。千日红（Gomphrena globosa）是较好的指示植物，除HB株系外都产生局部斑[8，9]。

对于PVX株系的分类还未有统一的标准，但Cockerham[10]的方法认可度较高，该方法根据PVX侵染携带不同抗病基因（Nx和Nb）的马铃薯植株所表现出的症状，将PVX株系分为4组，分别是X1、X2、X3和X4。X1组（如CS35株系）在含Nx、Nb基因的马铃薯上均能引起过敏反应（Hypersensitive resistance，HR）。X2组（如CP株系）只在含Nb基因的马铃薯上引起HR。X3组（如UK3、DX株系）只在含有Nx基因的马铃薯上引起HR。X4组（如DX4、CP4、HB株系）则能完全克服Nx、Nb抗性。许多研究表明，PVX的外壳蛋白（Coat protein，CP）基因在决定PVX与植物抗病基因互作方面起着重要作用。CP可作为激发子使马铃薯产生HR、ER（极端抗病性，extreme resistance，ER）反应，CP基因核苷酸序列的变化会导致寄主产生不同的症状类型。因此，PVX的CP基因序列分析也有助于对PVX的分类研究[11～16]。

2 PVX的基因组结构与功能

PVX基因组由一条单组分的正单链RNA分子组成，长度约6.4 kbp。RNA的5′-末端有m7GpppA帽子结构，3′-末端有1个poly（A）尾结构，共包含5个开放式阅读框（Open reading frane，ORF）。ORF1编码166 kDa的RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp），是PVX合成RNA必需的，也是唯一来源于自身的蛋白。中间的ORF2、ORF3、ORF4相互重叠，被称为三基因区段（Triple-gene block，TGB），分别编码25 kDa的TGBp1蛋白、12 kDa的TGBp2蛋白、8 kDa的TGBp3蛋白，这些蛋白与病毒在寄主细胞间的移动有关，其中，TGBp1蛋白已经被证明是一种转录后基因沉默的抑制因子，可打破寄主植物的防御反应，使病毒成功侵染。3′-末端的ORF5编码25 kDa的病毒外壳蛋白（Capsid protein，CP），除具有包装核酸的功能外，也是病毒在细胞间移动所必需的，而且还能起到复制调节的作用[17～19]。

另外，PVX基因组还包括5′-末端非翻译区域（5′-Untranslational region，5′-UTR）和3′-端非翻译区域（3′-Untranslational region，3′-UTR）。5′-UTR有84个核苷酸（nt），已有的研究表明，5′-UTR对于病毒的复制、细胞与细胞间的移动以及病毒的组装等有重要作用[20～23]。3′-UTR有72个核苷酸，含有多种重叠的作用元件，其中包括1个富含U的八核苷酸序列，对于病毒RNA与寄主蛋白之间的互作以及病毒的增殖起着重要作用[24]。

3 PVX的检测方法

PVX的检测方法较多，主要包括指示植物检测法、电镜检测法、免疫学检测法和核酸介导的分子生物学检测法。

3.1 指示植物检测法

指示植物检测法是利用指示植物被PVX侵染后所表现出的特异症状，来检测PVX是否存在。指示植物检测法简便可行，对仪器设备要求较低，可迅速掌握利用。吴凌娟等[9]用多种指示植物分离鉴定了PVX，结果发现千日红发病时间短、易观察，比较适合作为PVX检测的指示植物。常用于检测PVX的指示植物还包括白花刺果曼陀罗（Datura metel）、心叶烟（Nicotiana glutinosa）等。但指示植物检测法耗时较长，受环境影响较大，准确性和灵敏度不高，已不作为PVX检测和鉴定的主要方法，多用于分子生物学或免疫学检测之前的初步鉴定[25]。

3.2 电镜检测法

电镜检测法是开展植物病毒研究的常规手段之一，主要是通过观察病毒粒子形态、内含物、亚结构等方面的特征来确定病毒的种类。电镜的分辨率可达到0.5 nm，比指示植物法更直观、速度更快、观察结果也更准确。张仲凯等[26，27]利用电镜对云南地区的PVX等病毒进行了观察和鉴定。电镜还可以观测到病毒引起的寄主细胞的病变和内含体特征，是深度研究病毒病机理的重要手段。但是，电镜检测法所需仪器设备昂贵，操作过程繁琐，对人员要求较高，在PVX检测上应用较少。

3.3 免疫学检测法

①酶联免疫吸附法 酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）由Voller等[28]首次应用于植物病毒检测，主要是利用抗原与酶标抗体特异性结合以及底物的显色反应，检测病毒存在与否，并可对病毒含量进行初步测定。ELISA具有简便、快速、准确、灵敏度高等优点，适合于口岸、生产企业开展大样本检测。ELISA依据支持物的不同可分为双抗体夹心法（DAS-ELISA）和硝酸纤维素膜法（NCM-ELISA）。DAS-ELISA和NCM-ELISA在PVX检测上应用较为广泛。李云海等[29]利用ELISA对云南省马铃薯脱毒试管苗的PVX病毒进行了检测；白艳菊等[30]利用DAS-ELISA对黑龙江省主栽马铃薯品种的脱毒试管苗及田间收获薯块感染PVX的情况进行了检测；仲乃琴[31]利用DAS-ELISA对甘肃省种植的6个马铃薯品种的老龄薯、幼龄薯以及2个品种的茎尖组培苗携带PVX的情况进行了检测分析；张国柱[32]利用NCM-ELISA对山西省的主栽马铃薯品种PVX感染情况进行了检测，并均取得了较好的结果。

②免疫胶体金技术 免疫胶体金技术（Immune colloidal gold technique，ICG）是一种新型检测技术，该技术操作简单，样品用量较少、无需特殊处理，检测时间短，仅15 min便可完成，肉眼水平便可观察结果，特别适合口岸检疫、基层单位的实验室和大田病毒病害的快速检测[33，34]。魏梅生等[35]已研制出用于PVX检测的ICG试纸条，该试纸条的灵敏度和精确度均较高。张丽等[36]利用ICG技术对宁夏地区不同马铃薯品种及不同级别脱毒种薯的脱毒情况进行了检测，发现ICG检测效果与ELISA相当，但具有样本用量极小、操作简单等优点，适用于一级种薯田间小样本抽样检测。

3.4 分子生物学检测法

分子生物学方法在马铃薯病毒检测中的应用发展十分迅速。与传统马铃薯病毒检测方法相比，其具有灵敏度高、特异性好等优点，尤其是反转录-聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）和核酸斑点杂交（Nucleic acid spot hybridization，NASH）技术已经被广泛应用于PVX的检测。

①RT-PCR技术 RT-PCR技术以PVX的RNA为模板，通过反转录合成cDNA，然后对cDNA扩增，最后进行检测分析，该方法具有操作简单、灵敏度高、快速、特异性强、重复性好和取样量少等优点，十分适合种薯生产企业的质控管理[37]。关翠萍

等[38]运用一步RT-PCR法对马铃薯中的PVX等病毒进行了检测，建立了灵敏度较高的一步法RT-PCR检测技术。朱云芬等[2]建立了PVX的RT-PCR和

IC-RT-PCR（Immunocapture reverse transcription polymerase chain reaction）技术，认为这2种方法均具有较高的灵敏度，均可满足检测需求。在RT-PCR技术的基础上，研究者们进一步开发了多重RT-PCR技术，可对PVX等多种马铃薯病毒同时进行有效的检测[39～41]。

②NASH技术 NASH技术是将PVX基因组的一段核苷酸序列进行放射性或非放射性标记，制成探针，再与待检样品的核酸进行杂交，从而指示PVX的存在与否[42]。Eweida等[43]利用NASH检测PVX，结果表明该方法的灵敏度是ELISA的100～250倍。Katarzyna等[44]利用NASH对马铃薯组培苗中的PVX等病毒进行了多重检测。吴兴泉等[45]首次在国内研究建立了PVX的NASH检测技术，认为NASH可完全满足检测的实际要求。

4 PVX的防治技术

PVX的防治技术主要包括生产脱毒种薯、培育抗病毒品种和利用抗病毒化学药剂3个方面。生产脱毒种薯是目前最主要的防控措施，培育抗病品种是今后的发展方向，研发有效的抗病毒化学药剂也是一个重点领域。

4.1 脱毒种薯生产

脱除PVX的常用方法有热处理脱毒法、茎尖培养脱毒法、热处理结合茎尖培养脱毒法，其中热处理结合茎尖培养脱毒法应用最为广泛，脱毒效果也最显著[46，47]。PVX脱毒种薯的生产流程主要分为4步，第一步是在实验室利用上述脱毒方法去除PVX，得到马铃薯组培脱毒试管苗；第二步是在温室或者网室内开展微型薯（也称作原原种，薯块质量1～20 g）的生产；第三步是在田间开展原种（薯块质量小于

75 g）的生产；第四步是在田间开展一级种（也称作生产种，薯块质量50～100 g）的生产。在脱毒种薯的生产过程中，必须对各级种薯携带PVX的情况进行检测，严格控制种薯带毒率。

4.2 抗病品种培育

常规育种技术是马铃薯抗病毒病育种的主要途径之一，主要是通过杂交等方法，将抗性栽培种、野生种或近缘种的抗病基因引入到主栽品种

中[48，49]。目前，研究者们已经分离了多个抗PVX的基因。Ritter等[50]分离定位了PVX的极端抗性基因Rx1和Rx2，并将其引入到马铃薯育种材料中；Bendahmane等[51]在马铃薯栽培种Cara中分离了

PVX的极端抗性基因Rx，并将其定位于Ⅻ染色体上；Tommiska等[52]从二倍体栽培种Solanum phureja IvP35中分离到PVX高敏抗性基因Nxphu，并将其定位到Ⅸ染色体上。

植物转基因技术是马铃薯抗病毒病育种的一个新途径，主要是通过转基因手段，将具有抗PVX功能的外源基因整合到目标马铃薯品种的基因组中，增强其PVX抗性。这些功能基因种类较多，主要包括马铃薯自身的抗性基因、PVX外壳蛋白基因以及其他物种体内的抗性基因。张鹤龄等[53]、Doreste等[54]分别将PVX的CP基因转入马铃薯品种虎头、克新4号和cv. Desiree中，得到了具有较强PVX抗性的转基因株系。Lodge等[55]将美国商陆（Phytolacca americana）的PAP基因转入马铃薯品种Russet Burbank中，得到的转基因后代表现出较强的PVX抗性。

4.3 抗病毒病化学药剂的利用

利用化学药剂对PVX进行防治也是一个重点研究方向。研究表明，嘌呤、嘧啶碱基类似物等物质具有抑制PVX活性的功能。Huber等[56]研究发现，8-氮杂鸟嘌呤、8-氮杂腺嘌呤和6-丙基-2-硫代尿嘧啶对PVX具有明显的抑制作用；Schulze等[57]研究发现，6-氨基尿嘧啶、6-氨基胸腺嘧啶和9-（2，3-二羟基丙基）腺嘌呤具有抑制PVX复制的功能；Schuster等[58，59]发现，咪唑衍生物类物质病毒唑（三氮唑核苷）可完全抑制马铃薯茎培养物中PVX 的增殖，三嗪类衍生物DHT（2，4-二酮-六氢化1，3，5-三嗪）等对PVX也具有抑制作用。

5 PVX的应用

PVX主要用作植物外源基因的表达载体，研究者们多采用基因插入和融合蛋白2种构建方法构建PVX表达载体。基因插入法是将外源基因插入PVX的CP基因的2个重复启动子之间，利用CP基因的启动子来指导外源基因的表达。为了避免重复的启动子同源结合导致外源基因丢失现象的发生，通常利用内部核糖体进入位点（1RES）取代其中1个启动子[60]。融合蛋白是将目的基因以及通读序列插入CP基因之前，编码CP与目的基因的融合蛋白，然后利用病毒复制组装将目的蛋白呈现在病毒粒子表面，表达后再从植物中分离出重组病毒，用蛋白酶消化后进行提纯，得到抗原或非抗原药物蛋白[60～62]。PVX作为表达载体具有易转化、效率高等优点，在基础研究和生产上都得到了广泛的应用。Baulcombe等[63]、Avesani等[64]、Wagner等[65]、Zhou等[66]、杨凤萍等[67]先后利用PVX载体生产了绿色荧光蛋白GFP、胰岛素谷氨酸脱羧酶自抗原GAD65、植物过敏原、人巨粒细胞集落刺激因子GM-CSF和乙肝表面抗原HBsAg。PVX载体在商业上存在显著的应用价值，Fitchen等[68]利用PVX载体在烟草中生产儿童病毒性胃肠炎疫苗VP6蛋白，该方法生产的疫苗具有安全性高、数量大、成本低、储藏方便等优点。

6 展望

PVX病毒病是影响马铃薯生产的主要病害之一，对PVX开展深入研究具有重要的现实意义。目前有关PVX发生与分布、基因结构与功能、检测方法等方面的研究较多，也取得了较大的进展。PVX病毒病防治方面，主要采用茎尖脱毒以及三级快繁体系生产脱毒种薯，抗病毒病化学药剂因其防治效果有限，应用比较少。抗病毒病品种育种是PVX病毒病防治的主要发展方向，但这方面的研究进展较为缓慢，亟待加大研究力度，培育出既具有良好抗病性，又能满足生产实际需求的马铃薯品种。虽然PVX易对马铃薯生产造成较严重的影响，但我们可以充分利用PVX的生物学特性，根据实际需求，将其改造成携带外源基因的表达载体，生产所需蛋白，有关这方面的研究将极具应用前景。

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