人附睾蛋白4单克隆抗体与免放试剂盒的制备及其对卵巢癌诊断的临床价值探讨

王立凯 黄丽娟 潘学继 张续 董全文

300301，天津市协和化学发光诊断试剂有限公司研发中心（王立凯）；300301，天津市协和医药科技集团有限公司，天津市免疫分析技术企业重点实验室（王立凯、黄丽娟、潘学继、张续、董全文）

人附睾蛋白4单克隆抗体与免放试剂盒的制备及其对卵巢癌诊断的临床价值探讨

王立凯 黄丽娟 潘学继 张续 董全文

300301，天津市协和化学发光诊断试剂有限公司研发中心（王立凯）；300301，天津市协和医药科技集团有限公司，天津市免疫分析技术企业重点实验室（王立凯、黄丽娟、潘学继、张续、董全文）

目的 制备人附睾蛋白4（HE4）单克隆抗体并研制免放分析试剂盒，探讨其在卵巢癌临床诊断中的价值。方法 用重组人HE4免疫小鼠，通过细胞融合杂交瘤技术制备并筛选可以配对的HE4单抗，用125I标记其中一株单抗，研制HE4免放试剂盒，并评价其检测的灵敏度。通过检测临床血清标本来评价其对卵巢癌诊断的灵敏度和特异度。结果 筛选出了一对亲和力与特异性高的HE4单抗，其免放试剂盒检测的灵敏度为3.65 pmol/L，其对卵巢癌的临床诊断的灵敏度可达90.83%，特异度为99.17%。结论 制备的单克隆抗体亲和力高，研制的免放试剂盒各项指标较好，可用于卵巢癌的早期临床诊断和疗效观察，降低卵巢癌患者的病死率。

人附睾蛋白4；卵巢肿瘤；抗体，单克隆；免疫放射分析

Fund program:Key Projects of Tianjin Science and Technology Support Program（13ZCZDSY01000）

人附睾蛋白 4（human epididymis protein-4，HE4）是近年来发现的一个肿瘤标志物，主要是由附睾远端上皮细胞中的HE4基因所表达，由124个氨基酸组成，在精子的成熟过程中起着关键作用。HE4作为一种新型的卵巢癌诊断指标，其水平变化能反映卵巢癌发展的趋势，并能监测治疗的效果。HE4在正常人体中的表达非常低，但在卵巢癌组织和患者血清中均高度表达；在恶性肿瘤中的高表达多见于卵巢癌、子宫内膜癌。本研究旨在建立HE4双抗体夹心免放分析方法，评价该测定方法的灵敏度、特异度、精密度，并通过血清标本的检测来探讨HE4在卵巢癌临床诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

HE4重组抗原购自美国Fitzgerald公司；Na125I是委托中国同位素公司代购美国PerkinElmer公司的产品；SP2/0骨髓瘤细胞和蛋白A亲和层析柱由天健生物制药有限公司提供（天津）；BALB/C小鼠购自北京维通利华实验动物技术公司；DMEM高糖培养基购买自美国Gibco公司；弗氏佐剂购自美国Sigma公司；羊抗鼠IgG及辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗鼠IgG购自美国Scanbody公司；Multiscan MK3型酶标仪为芬兰雷勃公司产品；紫外分光光度计为北京普析通用仪器有限责任公司产品；GC-911型γ计数放免分析仪为科大创新股份有限公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 动物免疫

10只6周龄的BALB/C小鼠，将弗氏完全佐剂与HE4重组抗原乳化后进行腹腔注射，免疫剂量为50 μg/只。首次免疫后将弗氏不完全佐剂与HE4重组抗原乳化后进行腹腔注射，每2周进行1次加强免疫注射，免疫剂量为25 μg/只。加强免疫3次后，通过小鼠静脉采血，用ELISA法测定血清中抗体效价。当抗体效价达到1∶50 000，于细胞融合前3 d时再进行1次加强免疫（小鼠进行腹腔注射，免疫剂量为50 μg/只）。

1.2.2 细胞融合与筛选及亚克隆

本实验室采用最新的标准细胞融合技术，选取抗体效价最好的小鼠，收集脾淋巴细胞，与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合（用低分子量的聚乙二醇诱导）。将融合后的杂交瘤细胞接种至96微孔细胞培养板上，对培养基中的杂交瘤细胞进行ELISA筛选。将筛选出的阳性杂交瘤细胞克隆于24孔培养皿上进行扩大培养。将确定为阳性的细胞克隆进行亚克隆以获得能产生抗体并进行稳定传代的细胞系。

1.2.3 单抗亚型测定

用羊抗鼠IgG二抗包被96孔酶标板，在各孔中加入50 μl杂交瘤细胞培养液上清，并设立空白对照。37℃温育0.5 h后，再往各孔中分别加入50 μl HRP标记的兔抗鼠IgG，37℃温育30 min。洗板3次，加入100 μl 3,3′,5,5′,-四甲基联苯胺（TMB）底物显色，加入终止液后用酶标仪测定其450 nm处的OD值。

1.2.4 单克隆抗体的批量制备及纯化

针对每株杂交瘤细胞进行一次小批量的腹水生产（6只小鼠/株），用蛋白A层析柱从腹水样本中分离纯化单克隆抗体。通过紫外分光光度计测定抗体的浓度，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定抗体的纯度。

1.2.5 HE4标准品的配制

将0.05 mol/L、pH=7.2的PBS与胎牛血清配制成基础缓冲液，加入重组人HE4抗原，配制出浓度分别为0、30、80、200、500、1300 pmol/L的标准品。

1.2.6 包被管的制备

配制pH=9.0的0.01 mol/L的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲液；向其中加入HE4单克隆抗体，浓度为4 mg/L；将配制好的包被液按200 μl/管加入聚苯乙烯塑料管内；2～8℃放置24 h，倒掉液体，加入1.0 ml PBS洗管2次；200 μl/管封闭液（0.01 mol/L PBS，10 g/L BSA）2～8℃放置2 h后，将封闭液倒掉，晾干待用。

1.2.7 标记物的制备方法

取1 μg/μl鼠抗人HE4单克隆抗体100 μl，加入3.7×107Bq的Na125I，用磁力搅拌子边搅拌边加入氯胺T 30 μl（4.0 mg/ml）反应30 s；立即加入Na2S2O350 μl（4.0 mg/ml）反应20 s。用凝胶层析柱纯化分离，用PBS-BSA缓冲液配制标记物工作液，使100 μl标记物的每分钟放射性计数约为20万，2～8℃保存待用。

1.2.8 HE4免疫放射分析方法的建立

试剂盒上述主要组分制备完成以后，经过一系列的对比筛选试验，最终确定了HE4试剂盒的最佳操作方法和温育条件。

1.2.9 分析灵敏度的测定

连续测定20管零标准品，将其每分钟放射性计数值做统计，求出其平均值（X）及标准偏差（SD），取X＋2SD在标准曲线上所对应的浓度值即为本方法的分析灵敏度[1]。

1.2.10 精密度的测定

批内变异性：取低、高两个不同浓度的混合血清样品进行检测。每个样品做20管，计算测定浓度的X、SD，然后计算X/SD×100%，即为本方法的批内变异性；批间变异性：测定低、高浓度样品各10管，重复3次，计算3次测定的变异性。

1.2.11 回收率的测定

取一定量的HE4抗原，将其溶解于人基础血清中，配制成高、中、低3个不同浓度的样品，用本方法测定其浓度，然后计算实际测定值与理论值之间的比例即为回收率。

1.2.12 正常值范围的确定

采集200名正常人血清，用自制的HE4免放试剂盒测定其浓度，计算其X、SD，计算X＋2SD即为正常参考值上限，小于该值即为正常[1]。

1.2.13 临床标本的检测

测定120例用罗氏电化学发光试剂定值的卵巢癌患者血清样本，计算其阳性率；测定120名用罗氏试剂定值的正常人血清样本，计算其阴性率。并对测定结果进行对比分析。

3.3 科学合理用药，综合防治韭蛆 一是加强肥水管理，提高植株自身抗性，创造有利于韭菜生长，而不利于韭蛆等病虫害生长的生态环境条件。二是合理轮作，根据韭蛆危害程度确定适宜的轮作时间，至少与非百合科作物如辣椒、番茄、黄瓜等轮作3年以上。三是加强田间管理，及时清除韭菜残叶和杂草，沿宽行和簇间深锄松土，剔除簇心土，晒根晾土。四是使用腐熟的有机肥，提倡使用豆粕、菌渣等有机肥。五是提倡使用生物农药或采用高效、低毒、低残留化学农药，保障韭菜生产质量安全。

2 结果

2.1 细胞融合及阳性克隆筛选

通过对免疫小鼠血清抗体效价的测定，选取了1号、3号小鼠进行细胞融合，经阳性克隆筛选及亚克隆后，共获得了2株可以稳定分泌抗体的细胞株，分别命名为1A5和3D2，并对这两株细胞所分泌的抗体进行了亚型测定，结果显示均为IgG1型单抗。

2.2 单抗的批量制备及纯化

将上述 1A5和 3D2细胞株分别接种 6只BALB/C小鼠后，分别得腹水18.4 ml和20.7 ml，用蛋白A层析柱分离纯化后各得单克隆抗体66.3 mg和68.1 mg。用紫外分光光度计测定抗体的浓度分别为5.2 mg/ml和5.63 mg/ml。

2.3 单抗的纯度鉴定

将1A5和3D2两株单抗分别进行SDS-PAGE凝胶电泳（图1），两株单抗的电泳结果均为两条带，相对分子质量分别为25 000的轻链和50 000的重链。经扫描图谱分析后计算得出两株单抗的纯度均＞95%。

图1 纯化人附睾蛋白4单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE photo for purified human epididymis protein 4 monoclonal antibodies

2.4 抗体配对结果

经过一系列的筛选试验，最终确定本试剂盒的操作方法为：取100 μl标准品及血清标本加入包被试管，然后再加入100 μl125I标记的单抗工作液，室温振荡1 h，吸去管中液体，加入1 ml洗液洗管2次，然后再用γ计数器测定每管1 min内的放射性强度计数，测定结果如图2所示，可以看出，2株HE4单克隆抗体配对结果较好，非特异性结合率低，标准品各点的结合率梯度拉差明显，标准曲线的线性良好。

图2 人附睾蛋白4免疫放射分析法测定的标准曲线Fig.2 Standard curve of human epididymis protein 4 immunoradiometric assay

通过测定20管零标准品，得出本试剂盒的分析灵敏度为3.65 pmol/L。

2.6 精密度测定结果

通过对浓度分别为60、300 pmol/L的两个血清样本进行测定，计算出其批内变异性分别为5.31%和3.59%，其批间变异性分别为7.52%和5.17%。

2.7 回收率测定结果

通过对浓度分别为60、300和1200 pmol/L的3个血清样本测定，计算回收率分别为103.69%、102.64%和98.42%。

2.8 正常值范围的测定结果

测定了200名正常人血清，计算浓度的X= 98.43 pmol/L、SD=23.16、X＋2SD=144.75 pmol/L。因此，确定本试剂盒测定的正常值范围为＜145pmol/L。

2.9 临床样本的检测

通过对120例卵巢癌患者和120名正常人的血清样本的测定结果进行统计分析，本试剂盒的临床灵敏度可达90.83%、特异度为99.17%，基本接近罗氏电化学发光试剂盒的测定结果（表1）。

表1 人附睾蛋白4临床血清样本测定结果Table 1 Clinical test result of human serum for human epididymis protein 4

3 讨论

卵巢癌是目前最常见也是病死率最高的妇科肿瘤之一，中国每年约每2万女性中就有1人被诊断为卵巢癌。因临床症状不明显，很易造成漏诊与误诊，近75%的卵巢癌患者确诊时已处于晚期并扩散到其他器官，错过了最佳治疗时机。如卵巢癌发展到后期扩散到其他腹部器官才确诊，患者的5年生存率仅为17%。如能在转移前得到诊断，患者的生存率可以达90%以上。目前卵巢癌的主要血清标志物是CA125，但其灵敏度、特异度并不理想。因此，探讨对卵巢癌更灵敏、特异度高的早期诊断指标是非常必要的。HE4在早期及中后期的卵巢癌诊断中的灵敏度均高于CA125，特异度也优于CA125[2-3]。HE4与CA125联合应用，灵敏度可高达92%，可以减少30%～50%生物标志物阴性卵巢癌的漏诊，大大提高了卵巢癌诊断的准确率[4-6]。

本研究制备了一对高亲和力、高特异度的HE4单抗，用其研制出了HE4免放试剂盒，并对其在卵巢癌检测中的临床灵敏度及特异度进行了测定分析。对120例卵巢癌患者血清和120名正常人血清样本的检测结果进行分析，其临床测定的灵敏度可达90.83%，特异度为99.17%，基本接近进口罗氏电化学发光试剂盒的测定结果，优于目前国内已报道结果[7]。由于目前国内市场上的HE4被进口类产品所垄断，检测时需要有配套的大型仪器，且价格昂贵。本试剂盒与进口试剂相比，价格便宜，且操作方便快捷，对各型放免分析仪器完全开放，更适于在中小型医院及体检公司使用，可广泛应用于卵巢癌的早期诊断，有效提高卵巢癌的早期检出率，可做到早诊断早治疗，降低卵巢癌的病死率。

利益冲突 本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及任何利益冲突。

作者贡献声明 王立凯负责研究命题的提出与设计、方法建立和论文撰写；黄立娟负责单克隆抗体的制备；潘学继负责标记物制备及技术指导、论文审阅；张续负责数据处理与分析；董全文负责论文修订。

［1］国家食品药品监督管理局.肿瘤标志物类定量检测试剂注册申报资料指导原则[EB].2011-03-24,http：//www.sda.gov.cn/ WS01/CL0274/60448.html. China Food and Drug Administration.Guiding principles for registration of quantitative detecting kits of tumor markers[EB].2011-03-24,http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0274/60448.html.

［2］董丽,昌晓红,叶雪,等.血清人附睾分泌蛋白4和CA125水平检测在卵巢癌中的诊断价值[J].中华妇产科杂志,2008,43（12）：931-936.DOI：10.3321/j.issn：0529-567X.2008.12.013. Dong L,Chang XH,Ye X,et al.The values of serum human epididymis secretory protein 4 and CA125 assay in the diagnosis of ovarian malignancy[J].Chin J Obstet Gynecol,2008,43（12）：931-936.

［3］Kirchhoff C,Habben I,Ivell R,et al.A major human epididymisspecific cDNA encodes a protein with sequence homology to extracellular proteinase inhibitors[J].Biol Reprod,1991,45（2）：350-357.

［4］刘晓宇,姜洁.血清肿瘤标志物人附睾蛋白4在卵巢癌诊断中的研究进展[J].肿瘤,2010,30（8）：711-714.DOI：10.3781/j.issn.1000-7431.2010.08.015. Liu XY,Jiang J.Serum human epididymis protein 4 as a tumor marker in the diagnosis of ovarian cancer[J].Tumor,2010,30（8）：711-714.

［5］张卫云,孙朝晖,李薇,等.人附睾蛋白4与血清CA125联合检测在卵巢癌诊断中的应用价值[J].生物技术通讯,2013,24（4）：549-551.DOI：10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.025. Zhang WY,Sun ZH,Li W,et al.Diagnostic Value of Combined Detection of Human Epididymis Protein 4 with Serum CA125 in Ovarian Epithelial Cancer[J].Lett Biotech,2013,24（4）：549-551.DOI：10.3969/j.issn.1009-0002.2013.04.025.

［6］Moore RG,McMeekin DS,Brown AK,et al.A novel multiple marker bioassay utilizing HE4 and CA125 for the prediction of ovarian cancer in patients with a pelvic mass[J].Gynecol Oncol, 2009,112（1）：40-46.DOI：10.1016/j.ygyno.2008.08.031.

［7］王慜杰,齐军,王海,等.人附睾蛋白4与糖类抗原125联合检测在卵巢癌诊断中的应用价值[J].中华肿瘤杂志,2011,33（7）：540-543.DOI：10.3760/cma.j.issn.0253-3766.2011.07. 015. Wang MJ,Qi J,Wang H,et al.Diagnostic value of combining detection of human epididymis protein 4 and CA125 in patients with malignant ovarian carcinoma[J].Chin J Oncol,2011,33（7）：540-543.

Preparation of monoclonal antibodies and immunoradiometric assay kit against human epididymis protein 4 and its clinical value in diagnosis of ovarian cancer

Wang Likai,Huang Lijuan,Pan Xueji, Zhang Xu,Dong Quanwen
Union CLIA Diagnostic Technology（Tianjin）Ltd.,Tianjin 300301,China（Wang LK）;Key Lab of Immunoassay Technology for Tianjin′s Companies,Union Medical&Pharmaceutical Technology Group（Tianjin）Ltd.,Tianjin 300301,China（Wang LK,Huang LJ,Pan XJ,Zhang X,Dong QW）

Wang Likai,Email:research@union-med.com

Objective To prepare monoclonal antibodies and immunoradiometric assay kit against human epididymis protein 4(HE4)and study its clinical value in diagnosis of ovarian cancer.MethodsBALB/c mice were immunized with recombinant HE4 antigen,2 paired monoclonal antibodies were generated through splenic cell and myeloma cell fusion and screening.The detection antibody was labeled with 125 Iodine and immunoradiometric assay kit for HE4 was developed.The detect sensitivity of the kit was determined,and its clinical sensitivity and specificity in diagnosis of ovarian cancer was evaluated.ResultsTwo paired monoclonal antibodies with high affinity and specialty were generated. The detect sensitivity of this immunoradiometric assay was 3.65 pmol/L,and the clinical sensitivity and specificity in diagnosis of ovarian cancer was 90.83%and 99.17%respectively.ConclusionsThis study was prepared by a high affinity monoclonal antibodies against HE4,and the technical indexes of HE4 immunoradiometric assay kit were rather good.So it could be used in early diagnosis and curative effect observation of ovarian cancer,and reduce its lethality rate.

Human epididymis protein-4;Ovarian neoplasm,antibodies Monoclonal;Immunoradiometric assay

王立凯，Email：research@union-med.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.03.005

2013年天津市科技支撑计划重点项目（13ZCZDSY01000）

2016-02-26）