糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌中CaSR的表达①

秦文波，张　鹏，武　宁，李　璐

(1.佳木斯大学附属第二医院泌尿外科，黑龙江佳木斯154002;2.郑州市第七人民医院儿科，河南郑州450000)



糖尿病性ED大鼠阴茎海绵体平滑肌中CaSR的表达①

秦文波1，张鹏1，武宁1，李璐2

(1.佳木斯大学附属第二医院泌尿外科，黑龙江佳木斯154002;2.郑州市第七人民医院儿科，河南郑州450000)

摘要:目的:观察CaSR在糖尿病性勃起功能障碍(Diabetes mellitus－induced erectile dysfunction，DMED)大鼠阴茎海绵体平滑肌内的表达，揭示其与勃起功能障碍的关系。方法: 3月龄雄性Wistar大鼠(动物实验中心)随机分成3组:正常对照组、糖尿病模型组、糖尿病NPS2390组。采用ICP检测3组大鼠阴茎海绵体压力变化、采用免疫荧光法观察海绵体组织CaSR蛋白表达。HE染色法观察阴茎海绵体毛细血管数。结果:正常大鼠的阴茎海绵体平滑肌细胞有CaSR蛋白表达，且与正常对照组比较，糖尿病模型组和糖尿病NPS2390组大鼠阴茎海绵体组织CaSR蛋白含量增加(P＜0.01)，而阴茎海绵体毛细血管数减少(P＜0.01) ;且与糖尿病模型组比较，糖尿病NPS2390组CaSR蛋白含量明显减少(P＜0.01)，而阴茎海绵体毛细血管数明显增加(P＜0.01)。结论: CaSR有在阴茎海绵体平滑肌表达; CaSR参与了大鼠DMED的发生。

关键词:糖尿病;勃起功能障碍;钙敏感受体。

勃起功能障碍(Erectiledysfunedon，ED)是指持续或反复不能勃起或者勃起状态维持的时间不足以完成满意的性生活。国外流行病学调查显示，约7%～60%的男性患有程度不同的ED。而ED患者中，约40%患有糖尿病［1，2］。在男性糖尿病患者中发生ED的概率为未患有糖尿病ED的3～6倍［3，4］。对于糖尿病ED，其发生机制复杂，尚未完全清楚，缺少有效的治疗手段，已成为男性学科的热点。钙敏感受体(calcium－sensing receptor，CaSR)属G蛋白偶联受体C家族成员(该家族成员还包括mGluR、GABAb受体和信息素受体)。1993年，Brown EM等人在牛甲状腺中首次克隆出了CaSR［5］。2003年，Wang等［6］首次证实在大鼠心肌组织中存在着CaSR。而关于在阴茎海绵体平滑肌细胞有无CaSR的功能表达及其病理生理意义，目前相关报道很少。因此，本实验通过DMED模型的建立，及NPS2370的干扰，初步探讨CaSR与勃起功能障碍的关系。

1　材料与方法

1.1实验动物及材料

SPF(Specific pathogen Free，SPF)级纯系3月龄雄性Wistar大鼠(佳木斯大学动物实验中心提供) 40只，体重180～230g。STZ购自北京市博爱科贸有限责任公司，NPS2390购自美国Sigma公司，阿扑吗啡购自美国Sigma公司，兔源CaSR多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，FITC标记山羊抗兔IgG购自武汉博士德生物工程有限公司，抗荧光淬灭剂购自武汉博士德生物工程有限公司，考马斯亮蓝试剂盒购自南京建成生物工程研究所，PBS液购自佳木斯大学实验室。

1.2实验方法

1.2.1实验动物模型建立及分组

(1)正常对照组: 10只，仅经腹腔注射柠檬酸钠－柠檬酸缓冲液(30mg/kg) ; (2)糖尿病模型组: 10只，除对照组外大鼠高脂高糖饮食4w后，禁食16～18h，30只大鼠经腹腔注射1%链脲佐菌素(STZ)溶液(30mg/kg)，3d后，尾静脉取血，测空腹血糖，并观察大鼠禁食情况、饮水、尿量及体重变化。有多饮、多食、多尿、消瘦且血糖持续3周≥16.67mmol/L为造模成功未达标准者淘汰。将成模20只大鼠随机分为糖尿病模型组和糖尿病NPS2390(CaSR激活剂)组; (3) :糖尿病NPS2390组:另每周经尾静脉注射NPS2390(100mg/kg)二次。

1.2.2 APO实验

选择一安静的房间，在每只大鼠颈项背部皮下注射阿朴吗啡(100μg/kg)。注射以后观察每只大鼠在1h内有没有阴茎勃起，是否有张嘴反应并予以记录。龟头充血或阴茎体勃起成角大于90°记录为1次勃起。以每组中有阴茎勃起的大鼠的百分比为勃起率。

1.2.3阴茎海绵体中蛋白测定(考马斯亮蓝法测定)

(1)标准曲线测定法:取6只试管，1只做为空白对照，仅加入蒸馏水1.0mL，其余5只分别加入不同体积以及浓度为100μg/mL牛血清白蛋白的标准液，添加蒸馏水至1.0mL。再在每只试管内分别加入考马斯亮蓝G－250试剂5.0mL，盖上塞子，震荡，静置5min后在紫外线下在分光光度计585nm处测定吸光值。以牛血清清蛋白标准液的含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)蛋白样品:备100ug/mL的待测阴茎海绵体匀浆溶液。取一只试管做为空白对照，只添加蒸馏水1.0mL，一支加入0.5mL待测液，补充蒸馏水到1.0mL。然后每支试管均加入5.0mL考马斯亮蓝G－250试剂，盖上塞子，震荡，静置10min，在585nm处，用紫外可见分光光度计测定吸光值。用测得的结果从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的数量，计算得出待测阴茎海绵体匀浆溶液中蛋白质的含量。为减小测定误差，测定中，每一个浓度标准蛋白质和待测蛋白质样品需做3支平行管。根据所测样品的吸光度值，结合标准曲线，查出相应的蛋白质含量(μg)，按下式计算:

样品蛋白质含量鲜重= (查得的蛋白质含量×提取液总体积) /(样品鲜重×测定时取用提取液的体积)

1.2.4 HE染色观察阴茎海绵体组织毛细血管数目

采用苏木素－伊红(Hematoxylin and eosin，HE)染色观察阴茎海绵体血管:取大鼠阴茎海绵体做常规石蜡切片，对标本HE染色，对比二者改变。每张切片随机选取20个不同视野，镜下计录毛细血管数目。

1.2.5激光共聚焦显微镜荧光分析

(1)常规脱蜡至水:放入二甲苯Ⅰ20min、二甲苯Ⅱ20min→100%酒精Ⅰ10min、100%酒精Ⅱ10min→95%、90%、80%、70%酒精各10min→蒸馏水2min三次。

(2)热修复抗原:放入0.01M枸椽酸盐缓冲液(pH =6.0)中，在微波炉加热下至液体沸腾后，自然冷却至室温，反复1次(10min后)，PBS(pH 7.2～7.6)洗涤5min，3次。

(3)抗原修复液修复:滴加抗原修复液，湿盒置于37℃恒温水浴箱中孵育15min，之后PBS洗涤5min，3次。

(4)血清封闭:用纸巾吸干组织周围多余液体，摆放湿盒中，滴加血清封闭，湿盒置于37℃恒温水浴箱中孵育20min，不洗。

(5)加一抗:滴加CaSR抗体于切片上，湿盒置于4℃冰箱过夜。

(6)取出湿盒恢复室温30min，之后PBS洗涤5min，3次。

(7)滴加荧光标记二抗:湿盒置于37℃恒温水浴箱孵育90min。PBS洗涤5min，3次。

(8)激光扫描共聚焦显微镜取图，取图条件:激发光波长: 488nm;扫描方式: xyz;物镜: 20倍干镜(NA为0.75) ;激光功率: (20±2) mw;扫描强度: 50%;光电倍增管的增益(PMT) : 852;探测针孔: 2.02;扫描次数: 4。

1.3统计学方法

采用SAS(9.13版)软件处理实验数据，调用Proc GLM过程进行方差分析，各实验组与对照组的比较采用dunnet t检验，P＜0.01表示有统计学意义，保留且进行相关分析。

2　结果

2.1勃起次数及勃起率测定

与正常对照组比较，糖尿病模型组和糖尿病NPS2390组阴茎勃起次数和勃起率均降低;与正常组相比较，糖尿病组阴茎勃起次数和勃起率明显降低，而糖尿病NPS2390组相比较有所回升，与正常组非常接近，见表1。

表1　各组勃起率的变化情况(±s，n =10)

表1　各组勃起率的变化情况(±s，n =10)

组别　　勃起次数　　勃起率(%)正常对照组　3.5±0.4　100(10/10)糖尿病模型组　2.2±0.3　60(6/10)糖尿病NPS2390组　3.2±0.2　90(9/10)

2.2免疫荧光检测大鼠阴茎海绵体平滑肌钙敏感

受体蛋白的表达

与正常对照组比较，糖尿病模型组和糖尿病NPS2390组大鼠阴茎海绵体平滑肌组织钙敏感受体蛋白表达增加(P＜0.01)，且糖尿病模型组与糖尿病NPS239组比较，大鼠阴茎海绵体平滑肌组织钙敏感受体蛋白表达明显增加，差异有显著性(P＜0.01)，见表2，图1～3。

表2　大鼠阴茎海绵体组织钙敏感受体蛋白表达(±s，n =10)

表2　大鼠阴茎海绵体组织钙敏感受体蛋白表达(±s，n =10)

组别　　荧光强度(means±s.e.m)正常对照组1.09±0.03糖尿病模型组　1.72±0.08糖尿病NPS2390组1.23±0.05

2.3大鼠阴茎海绵体组织中毛细血管数目检测

与正常对照组比较，糖尿病模型组和糖尿病NPS2390组大鼠阴茎海绵体组织中毛细血管数目减少(P＜0.01)，且糖尿病模型组与糖尿病NPS2390组比较，大鼠阴茎海绵体组织中毛细血管数目明显减少，差异有显著性(P＜0.01)。

表3　各组大鼠阴茎海绵体组织中毛细血管数目(±s，n =10)

表3　各组大鼠阴茎海绵体组织中毛细血管数目(±s，n =10)

组别　　毛细血管数目(根/HP)正常对照组13.90±3.40糖尿病模型组　8.20±2.30糖尿病NPS2390组11.35±1.50

图1　正常对照图CaSR蛋白表达(免疫荧光，×600)

图2　糖尿病模型组CaSR蛋白表达(免疫荧光，×600)

图3　糖尿病NPS2390组蛋白表达(免疫荧光，×600)

3　讨论

阴茎勃起的基础是阴茎海绵体平滑肌的舒张。众多证据提示，与其他血管组织一样，阴茎海绵体平滑肌紧张性的主要调节物质是钾通道、钙通道。而Ca2 +是触发肌细胞收缩的关键介质，其阻滞细胞内［Ca2 +］i的升高是导致平滑肌松弛的有效途径。综上所述，研究阴茎海绵体平滑肌细胞膜钙通道对ED的发生机制有至关重要的作用［7］。钙敏感受体(calcium－sensing receptor，CaSR)是G蛋白耦联受体的C家族成员。由Brown et al于1993年首次于牛甲状旁腺克隆出CaSR。CaSR的主要作用是维持Ca2 +和其他金属离子稳态，也可调节细胞增殖、分化、离子通道开启、激素分泌等。细胞外Ca2 +是CaSR的主要配体，而Mg2 +、Gd3 +、新霉素、精胺(spermine)等多价阳离子亦可是CaSR的激动剂［8］。实验首先建立糖尿病大鼠模型，通过APO (100μg/kg)进行阴茎勃起，结果显示糖尿病模型组阴茎勃起次数和勃起率降低，同时经尾静脉注射NPS2390(CaSR抑制剂)后，改善海绵体内压的降低。可知由STZ诱发的DM可影响雄性大鼠的性功能，并可导致DMED，CaSR的激活显著影响了糖尿病大鼠的性功能，进一步加重了DMED的发生。采用免疫荧光检测大鼠阴茎海绵体平滑肌CaSR蛋白的表达。与正常对照组比较，糖尿病模型组大鼠阴茎海绵体平滑肌组织中CaSR蛋白表达增加，而糖尿病NPS2390组增加不明显。且通过免疫荧光实验进一步证实了大鼠阴茎海绵体组织中CaSR的存在以及DMED时阴茎海绵体中CaSR表达增加。

本课题还研究了CaSR与大鼠阴茎海绵体毛细血管的关系，制取大鼠阴茎海绵体做石蜡切片，HE染色，观察阴茎海绵体毛细血管数，并对比两者改变。结果示:与正常组相比较，糖尿病及糖尿病NPS2390组的血管数目较低，并且糖尿病组的血管数目减低明显，两组比较有显著的差异性。因此，2型糖尿病时NPS2390抑制CaSR后可遏制阴茎海绵体毛细血管的减少，缓解海绵体血供不足的问题，进而参与DMED的发生。由此可知，CaSR在DMED的发生发展中发挥重要作用。但对于该过程的具体调控和相关的分子机制以及是否涉及其它信号分子，是否还有其他途径的参与，还需更深入的研究。

参考文献:

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［5］Brown EM，Gamba G，Riccardi D，et al.Cloning and characterization of an extracellular Catsensing receptor from bovine parathyroid［J］.Nature，1993，366(6455) : 575－80

［6］Wang R，Xu C，Zhao W，et al.Calcium polyamine reglated calcium －sensing receptors in cardiac tissues［J］.Eur Biochem，2003，270 (12) : 680－688

［7］González－Corrochano R，La Fuente JM，Cuevas P，et al.Ca2 +－activated K+channel (K(Ca) ) stimulation improves relaxant capacity of PDE5 inhibitors in human penile arteries and recovers the reduced efficacy of PDE5 inhibition in diabetic erectile dysfunction ［J］.Br J Pharmacol，2013，169(2) : 449－461

［8］Brown EM，MacLeod RJ.Extracellular calcium sensing and extracellular calcium signaling［J］.Physiol Rev，2001，81(1) : 239－297

(收稿日期:2015－01－04)

通讯作者:张鹏(1981～)男，黑龙江佳木斯人，在读硕士研究生，主治医师。E－mail: zhangpeng1981@163.com。

作者简介:①秦文波(1956～)男，黑龙江宝清人，学士，教授，硕士研究生导师。

中图分类号:R587.1

文献标识码:A

文章编号:1008－0104(2016) 02－00102－03