豌豆蚜为害对苜蓿品种酶活性和营养物质的影响

张洪英，魏淑花，张 蓉，苗 润，李克昌，罗晓玲，张 宇

(1.宁夏农林科学院植物保护研究所，宁夏银川 750002;2.宁夏大学农学院，宁夏银川 750001; 3.宁夏草原工作站，宁夏银川 750002)

豌豆蚜为害对苜蓿品种酶活性和营养物质的影响

张洪英1，2，魏淑花1，张 蓉1，苗 润2，李克昌3，罗晓玲3，张 宇3

(1.宁夏农林科学院植物保护研究所，宁夏银川 750002;
2.宁夏大学农学院，宁夏银川 750001; 3.宁夏草原工作站，宁夏银川 750002)

为了探讨苜蓿(Medicago sativa)对蚜虫取食防御反应的生化机制，本研究通过室内人工接虫，研究了豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)取食后苜蓿体内防御性酶活性、营养物质含量的动态变化。结果表明，豌豆蚜为害7 d后，与低抗品种(惊喜、WL343HQ和德宝)相比，抗虫品种(三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030)的苜蓿幼苗苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及可溶性糖活性变化总体上显著增高(P＜0.01)，多酚氧化酶(PPO)和过氧化氢酶(CAT)活性变化显著降低(P＜0.01)，中抗品种(柏拉图、甘农4号、先行者和中苜3号)介于其间，可溶性蛋白质含量变化量无明显规律。

苜蓿品种;豌豆蚜;危害胁迫;防御性酶;营养物质

目前，宁夏地区种植高产优质苜蓿面积约39万hm2，占地区牧草种植总面积的66%［1］。苜蓿大面积的连年种植，导致病虫害问题日益严重，成为苜蓿品种选育和影响苜蓿产量的重要因子［2］。蚜虫是为害苜蓿最为严重的害虫类群之一，在宁夏主要有豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、苜蓿斑蚜(Therioaphis trifolii)、苜蓿无网蚜(Acyrthosiphon kondoi)和豆蚜(Aphis craccivora) 4种蚜虫，其中，豌豆蚜为优势种［3］。豌豆蚜喜聚集在苜蓿的细嫩部位吸食汁液，如嫩茎、嫩梢、幼芽、叶片、花和果实等部位［4］，使苜蓿叶片卷缩，变黄，甚至全株枯死。豌豆蚜取食时大量排泄蜜露，蜜露霉变后严重影响苜蓿质量和品质，失去其加工价值，家畜拒食［5］。豌豆蚜还传播苜蓿花叶病毒，造成的经济损失远远超过其直接为害的损失［6］。

宁夏地区现阶段防治豌豆蚜的主要措施是提前刈割和化学农药相结合的方法［7-8］。由于化学农药的大量使用，导致蚜虫的抗药性、再增猖獗和农药残留等问题日益突出［9］。开展苜蓿抗蚜性品种研究、选育及推广使用不仅能减少化学农药的使用对生态环境的影响，还是综合治理蚜虫的有效生态措施。因此，本研究拟通过室内人工接虫方法，对宁夏地区主栽的12个苜蓿品种，豌豆蚜取食为害后，苜蓿体内苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性动态变化及可溶性糖和可溶性蛋白质含量变化率进行测定，以期了解不同抗性苜蓿品种受豌豆蚜为害后体内发生的防御性反应，明确各项生理指标与苜蓿抗蚜性之间的关系，初步确定出豌豆蚜胁迫的诊断指标，为应用抗性苜蓿品种治理豌豆蚜提供依据。

1 材料与方法

1.1供试材料

1.1.1供试苜蓿品种 选用宁夏地区主栽的12个苜蓿品种为供试材料，分别为三得利、MF4020、皇后、SR4030、皇冠、柏拉图、甘农4号、中苜3号、先行者、惊喜、WL343HQ和德宝。依据国家牧草产业体系——盐池综合试验站项目田间及室内筛选评价，得出供试苜蓿品种分抗虫(R)、中抗(MR)和低抗(LR) 3个级别。其中5个抗虫品种为三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030，4个中抗品种为柏拉图、甘农4号、先行者和中苜3号，3个低抗品种为惊喜、WL343HQ和德宝。

1.1.2供试虫源 试验虫源采自宁夏贺兰山茂盛草业公司试验基地苜蓿植株上自然发生的豌豆蚜成蚜。

1.2试验方法

1.2.1试验处理 于2014年4月11日将供试12个不同抗蚜性苜蓿品种在温室种于花盆(25 cm×30 cm)中，每品种6盆集中放置，品种间行距1 m，常规管理，不做任何处理。出苗整齐后进行间苗，每盆保留20株长势一致的苜蓿幼苗。由于苜蓿幼苗对豌豆蚜刺吸胁迫耐受性是有一定限度的，若每株接种蚜虫过多，苜蓿幼苗体内的自身保护机制可能遭到破坏［10-11］，因此按每株30头虫口密度接种豌豆蚜成蚜。将田间采回的健壮豌豆蚜成蚜轻轻抖动于花盆中的白纸上，让其自然爬上苜蓿植株。接种后每一品种集中用网纱(1 m×1 m×1 m)罩住，以防蚜虫逃走和外来天敌入侵。分别于接虫后3、7、10 d［12］剪取植株用于酶活性测定，以不接蚜为对照，每测定重复3次。

1.2.2测定方法 PAL、PPO酶活性测定参照孙群和胡景江［13］方法，POD酶活性测定参照王伟玲等［14］方法，SOD、CAT酶活性测定参照李晶等［15］方法，分别测定豌豆蚜为害前后不同抗性苜蓿品种5种酶活性和营养物质含量的变化量。

酶活性变化量= (接蚜后的酶活性－同期未接虫的酶活性) /同期未接蚜的酶活性;

营养物质含量变化量= (接蚜后的含量－同期未接虫的含量) /同期未接蚜的含量。

1.2.3数据处理 运用Excel 2007进行数据统计，SAS 8.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1豌豆蚜为害后PAL活性变化

为害7 d后，PAL酶活性增加量明显高于为害10 d和为害3 d的。5个抗虫品种(三得利、MF4020、皇后、皇冠和SR4030)的PAL酶活性变化量在为害3、7、10 d后均极显著高于3个低抗品种(惊喜、WL343HQ和德宝) (P＜0.01)，但抗虫品种间以及低抗品种间的酶活性增加量差异不显著(表1)。

豌豆蚜为害3 d后，三得利PAL酶活性变化量极显著高于4个中抗品种和3个低抗品种(P＜0.01)。MF4020、皇冠、SR4030酶活性变化量与柏拉图、甘农4号PAL酶活性变化量之间差异不显著(P＞0.01)，但极显著高于先行者、中苜3号。柏拉图、甘农4号与3个低抗品种间差异极显著。先行者、中苜3号与3个低抗品种间差异不显著(P＞0.01)。为害7 d后，三得利、皇后PAL酶变化量极显著高于甘农4号、先行者、中苜3号3个中抗品种和3个低抗品种。甘农4号极显著低于5个抗虫品种，极显著高于3个低抗品种。为害10 d后，5个抗虫品种的PAL酶活性变化量极显著高于4个中抗品种和3个低抗品种。其中抗虫品种三得利的PAL酶活性变化量在供试的12个品种中一直保持着较高的水平，而3个低抗品种酶活性变化量则一直在较低水平。

2.2豌豆蚜为害后不同苜蓿品种PPO活性变化

在豌豆蚜为害苜蓿期间，5个抗虫品种PPO酶活性变化量极显著高于3个低抗品种(P＜0.01) ; 4个中抗品种(柏拉图、甘农4号、先行者和中苜3 号) PPO酶活性变化量位于抗虫品种和低抗品种之间(表2)。

表1 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种PAL活性变化量Table 1 PAL activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

表2 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种PPO活性变化量Table 2 PPO activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

豌豆蚜为害3 d后，抗虫品种三得利、MF4020、皇后、SR4030极显著高于其它品种(P＜0.01)。为害7 d后，抗虫品种三得利、MF4020、SR4030极显著高于其它品种。3个低抗品种酶活性变化极显著低于其它品种。为害10 d后，苜蓿品种酶活性变化量下降较快，降至豌豆蚜为害后的最低值。抗虫品种三得利、皇后、皇冠与中抗品种柏拉图、甘农4号差异不显著(P＞0.01)，但极显著高于中抗品种先行者、中苜3号和3个低抗品种。其中抗虫品种三得利的PPO酶活性变化量在所供试苜蓿品种中一直保持较高的水平，而3个低抗品种酶活性变化量在所有供试品种中一直保持较低水平。

2.3豌豆蚜为害后SOD活性变化

豌豆蚜为害7 d后，所有品种SOD酶活性增加量达最大，为害10 d次之，为害3 d最小(表3)。5个抗虫品种在豌豆蚜为害期间，酶活性变化量均极显著高于3个低抗品种(P＜0.01) ;4个中抗品种酶活性增加量介于5个抗虫品种和3个低抗品种之间(表3)。

豌豆蚜为害3 d后，除三得利外，其余4个抗虫品种酶活性变化量与柏拉图差异不显著(P＞0.01)，但极显著高于甘农4号、先行者、中苜3号3个低抗品种。三得利酶活性增加量极显著高于中抗与低抗品种，德宝酶活性增加量最低。为害7 d后，5个抗虫品种间差异不显著(P＞0.01)。柏拉图与甘农4号差异不显著，但极显著高于先行者、中苜3号和3个低抗品种。为害10 d后，三得利、MF4020、皇冠极显著高于其它品种，柏拉图与甘农4号差异不显著(P ＞0.01)，但两者极显著低于先行者、中苜3号，先行者与中苜3号间差异不显著(P＞0.01)。

表3 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种SOD活性变化量Table 3 SOD activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

2.4豌豆蚜为害后POD活性变化

所有品种POD酶活性增加量随豌豆蚜为害时间的延长持续升高，为害10 d后，POD升高量达到最大，7 d次之，3 d最低(表4)。在为害7和10 d后，5个抗虫品种增加量均极显著高于3个低抗品种(P＜0.01)。

豌豆蚜为害3 d后，4个中抗品种POD酶活性变化量处于5个抗虫品种和3个低抗品种之间。三得利、MF4020极显著高于除皇后外的其它品种(P ＜0.01)，三得利、MF4020与皇后酶活性变化量差异不显著(P＞0.01)，惊喜与WL343HQ、德宝间差异不显著(P＞0.01)，WL343HQ明显低于这两个品种。为害7 d后，三得利、皇后和柏拉图酶活性增加量极显著高于中抗和低抗其余品种。MF4020、皇冠、SR4030间的酶活性变化量差异不显著(P＞0.01)，甘农4号、先行者、中苜3号和3个低抗品种间的差异极显著。为害10 d后，抗虫品种三得利酶活性变化量极显著高于其它品种，德宝酶活性变化量极显著低于其它品种。

2.5豌豆蚜为害后CAT活性变化

所有供试品种的CAT活性均比未接虫对照下降，为害7 d后下降迅速，为害10 d次之，为害3 d最小。豌豆蚜为害10 d后5个抗虫品种CAT酶活性下降量均极显著低于3个低抗品种(P＜0.01)，4个中抗品种CAT酶活性变化量处于5个抗虫品种和3个低抗品种之间(表5)。

豌豆蚜为害3 d后，5个抗虫品种与柏拉图之间CAT酶活性变化量差异不显著，3个低抗品种之间CAT酶活性变化量差异不显著(P＞0.01)。为害7 d后，5个抗虫品种间酶活性变化量差异不显著(P ＞0.01)，3个低抗品种间差异不显著(P＞0.01)。为害10 d后，三得利、MF4020酶活性变化量极显著高于皇冠、SR4030，但与皇后差异不显著(P＞0.01)。4个中抗品种间CAT酶变化量差异不显著(P ＞0.01)。3个低抗品种间差异不显著(P＞0.01)。

表4 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种POD活性变化量Table 4 POD activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisumm

表5 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种CAT活性变化量Table 5 CAT activity change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

2.6豌豆蚜为害后营养物质含量变化

可溶性糖含量变化量随着为害时间的延长无明显变化规律(表6)。豌豆蚜为害3 d后，MF4020下降量最大，而德宝下降量最少;为害7 d后，惊喜可溶性糖含量增加量极显著高于三得利、MF4020、皇后、SR4030、柏拉图;为害10 d后，接虫三得利、MF4020、皇后、皇冠、SR4030、柏拉图、先行者和甘农4号可溶糖含量较未接虫的对照低，中苜3号和3个低抗品种高于对照，3个抗虫品种可溶性糖含量变化量极显著高于其它品种。

豌豆蚜为害期间，所有品种均较同期未接虫对照可溶性蛋白质含量降低(表7)。为害3 d后，SR4030可溶性蛋白质含量下降量极显著低于中抗和低抗品种。为害7 d后，三得利、皇后和WL343HQ极显著高于SR4030、中抗品种及惊喜品种。为害10 d后，三得利、MF4020、皇后、皇冠、SR4030可溶性蛋白质含量变化量极显著高于其它品种。

表6 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种可溶性糖含量变化量Table 6 Soluble sugar content change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

表7 豌豆蚜为害后不同抗性苜蓿品种可溶性蛋白质含量变化量Table 7 Soluble protein content change amount of various resistant alfalfa cultivars after damaged by Acyrthosiphon pisum

3 讨论与结论

豌豆蚜为害后，所有品种PAL、PPO、POD、SOD活性均有不同程度的增加，5个抗虫品种的酶活性基本上极显著高于3个低抗品种，4个中抗品种介于两者之间。PAL、PPO、POD、SOD活性越高，苜蓿品种抗蚜性越强;所有品种CAT活性均有不同程度的下降，5个抗虫品种的CAT酶活性均极显著高于3个低抗品种，4个中抗品种介于两者之间，CAT活性下降速率越慢，苜蓿抗蚜性越强。

豌豆蚜为害3 d后，供试品种的可溶性糖含量都较未接虫对照下降;为害7 d后，所有品种较对照上升;为害10 d后，3个低抗品种和中苜3号较对照上升，其它品种较对照下降。可溶性糖含量下降量越快，苜蓿抗蚜性越强。苜蓿品种体内可溶性蛋白质含量均比未接虫对照下降。为害3 d、7 d变化无规律;为害10 d后，5个抗虫品种可溶性蛋白质含量下降量极显著高于低抗品种。豌豆蚜为害后可溶性蛋白质含量与抗蚜性关系还需作进一步探讨。

在植物与昆虫的长期协同进化过程中，植物对害虫的胁迫可及时作出积极、主动的机体防御，以减少昆虫对它的危害，为植物自身寻求最适的生存对策［16］。本研究中受豌豆蚜为害后12个不同抗性苜蓿品种防御性酶(PAL、PPO、POD、SOD、CAT)和可溶性糖、可溶性蛋白质含量均发生了不同程度的变化。

本研究所测定的5种酶是植物次生代谢过程中的关键酶。PAL是催化苯丙烷类代谢途径第一步反应的酶，因为苯丙烷类代谢是植物抗性反应的重要代谢途径之一，所以PAL是这一途径的关键酶和限速酶［17-20］。植物抗虫性强弱与该途径的中间产物(酚类物质)以及终产物(木质素、黄酮、异黄酮类物质)密切相关［20-22］。毛红等［23］研究表明，绿盲蝽(Apolygus lucorum)取食后抗性棉花品种叶中PAL酶的活性显著高于感性品种。程璐等［11］研究表明，豌豆蚜为害后，所有苜蓿品种叶片内PAL酶活性随着时间的增加而升高。本研究中各品种PAL酶活性变化量在豌豆蚜为害3 d、7 d后持续升高，为害10 d后增加量略有下降。本试验与程璐等［11］和毛红等［23］研究结果相一致。由此可见，苜蓿叶片细胞在豌豆蚜为害时不断进行自我修复［11］，诱导更多酚类、黄酮等对昆虫有毒物质的生成［23］，以抵抗豌豆蚜的进一步侵害。PPO可催化酚类物质变为毒性更强的醌类或其衍生物，构成保护性屏蔽，直接发挥抗虫作用［24］，还与植物体内木质素的合成有关［25］，其活性高低与植物抗虫性有很大关系［18，24］。研究表明［10，12，26-27］，PPO活性随着豌豆蚜为害时间的延长而升高，抗蚜性越高的品种PPO酶活性上升越快。本试验表明，随着豌豆蚜为害时间的延长，PPO酶活性迅速增强而后趋于平稳。豌豆蚜为害刺激后苜蓿叶片迅速促使木质素的合成和积累，增加豌豆蚜取食的难度，抵抗豌豆蚜的为害。POD、SOD、CAT酶是与植物活性氧代谢的相关酶。昆虫的取食会打破植物体内活性氧代谢系统平衡，体内脂膜过氧化及膜脂脱脂作用启动，破坏膜结构［28］，引起植物体内POD、SOD、CAT抗氧化酶活性的变化［29］，及时有效地清除体内的活性氧，保护植物体不受伤害。高等植物叶绿体和细胞质中的SOD清除活性氧时形成H2O2，CAT清除H2O2形成H2O和O2［30］; POD可以催化酚类物质氧化，形成由自由基聚合成的木质素，同时也清除H2O2，这3种酶共同作用减轻害虫对植物造成的伤害［18］。高勇等［31］表明，绿盲蝽为害后，枣树(Ziziphus jujaba)叶片内SOD活性随着为害程度的加重先上升后下降; POD活性持续升高; CAT活性与对照(未受害)之间差异不显著。本试验表明，豌豆蚜为害一定时间内各品种SOD和POD活性高于未接虫对照，CAT活性低于未接虫对照。说明受豌豆蚜为害时，迅速启动苜蓿体内的3大保护酶，3种酶彼此协调共同清除O2－以减少膜脂过氧化的程度，减轻豌豆蚜取食对苜蓿造成的伤害。

一般来说，营养物质是植物生长发育必不可少的物质。绿色植物具有维持蚜虫营养所需的成分，植物体内营养物质含量过多或过活及其比率的不平衡使得植物对昆虫的抗生性产生影响［32］。李进步等［33］研究表明，棉蚜(Aphis gossvpii)的生长发育与棉花叶片可溶糖含量呈正相关。武德功等［34］表明，感虫品种和抗虫品种的可溶性蛋白质含量低于低抗品种。本研究表明，受豌豆蚜为害后，苜蓿体内可溶性糖含量呈先上升后下降趋势，可溶性蛋白质含量变化无规律。较低含量的可溶性糖类可导致苜蓿的适口性降低，抑制豌豆蚜的取食。

在豌豆蚜为害苜蓿期间，酶活性的变化和营养物质的含量变化是一个动态过程，因此，还需进一步研究不同虫口密度下，在不同时间段保护酶活性和营养物质的动态以及豌豆蚜取食后苜蓿植株的动态防御机制。

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(责任编辑 王芳)

Effects of Acyrthosiphon pisum on enzyme activities and nutrients ofdifferent alfalfa varieties

In order to investigate the biochemical mechanisms of alfalfa responses to pest aphid，the defensive enzyme activities and nutrients and their dynamic changes were studied in alfalfa varieties with different aphid resistance which were damaged by Acyrthosiphon pisum.The results showed that the activities of L-phenylalanin ammo-nialyase(PAL)，superoxide dismutase (SOD)，peroxidase (POD) and soluble sugar significantly increased (P＜0.01) within seven days of A.pisum damaged，whereas，the activities of polyphenol oxidase (PPO) and catalase (CAT) significantly declined (P＜0.01) in aphid resistance alfalfa varieties (Santory，MF4020，Queen，Crown，SR4030) compared with low resistance alfalfa varieties (Surprising，WL343HQ，Derby)，middle resistance alfalfa varieties (Platon，Gannong No.4，Pioneer，Zhongmu No.3) are somewhere in between.The soluble protein content changed without regular pattern.

book=145,ebook=149

alfalfa varieties; Acyrthosiphon pisum; hazard stress; defensive enzyme; nutrients

Zhang Rong E-mail: yczhrnx@163.com

S816.11; S551+.7

A

1001-0629(2016) 1-0144-09*

10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0283

张洪英，魏淑花，张蓉，苗润，李克昌，罗晓玲，张宇.豌豆蚜为害对苜蓿品种酶活性和营养物质的影响.草业科学，2016，33(1) : 144-152.

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2015-05-19 接受日期: 2015-07-02

国家牧草产业体系——盐池综合试验站(CARS-35-42) ;宁夏回族自治区农作物重大育种专项——苜蓿新品种选育(2014NYYZ03)

张洪英(1988-)，女，山东寿光人，硕士，主要从事草业植保研究。E-mail: zhy7515@126.com

共同第一作者:魏淑花(1980-)，女，宁夏吴忠人，助理研究员，硕士，主要从事农业昆虫与害虫防治研究。E-mail: weishuhua666@ 163.com

张蓉(1966-)，女，宁夏中卫人，研究员，博士，主要从事农业昆虫与害虫防治研究。E-mail: yczhrnx@163.com

Zhang Hong-ying1，2，Wei Shu-hua1，Zhang Rong1，Miao Run2，Li Ke-chang3，Luo Xiao-ling3，Zhang Yu3

(1.Institute of Plant Protection，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Yinchuan 750002，China; 2.Agriculture College，Ningxia University，Yinchuan 750001，China; 3.Grassland Workstation of Ningxia，Yinchuan 750002，China)