响应面法优化酵母增殖培养基

牛希跃，任晓镤，叶　林，兰鸿珠，许　倩（.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300)



响应面法优化酵母增殖培养基

牛希跃1，2，任晓镤1，2，叶林1，2，兰鸿珠1，许倩1，2
（1.塔里木大学生命科学学院，新疆阿拉尔843300；2.南疆特色农产品深加工兵团重点实验室，新疆阿拉尔843300)

摘要：为评价培养基成分（碳源、氮源、生长因子等)对酵母菌生长量的影响，利用Plackett-Burman实验研究主要影响因素，经最陡爬坡实验确定各因素峰值，再利用响应面法优化主要影响因素。结果表明，最适培养基配方为蔗糖58 g/L、苹果汁22 mL/L、蛋白胨12 g/L、马铃薯汁10 mL/L、酵母粉10 g/L、氯化钙0.1 g/L、磷酸氢二钾1 g/L，在pH4.5条件下28℃培养24 h，酵母菌的生长量为8.8748 cfu/mL。优化后的培养基与传统的YPD培养基（8.5543 cfu/mL)相比，酵母菌菌数提高明显。

关键词：酵母；培养基；PB设计；响应面

酵母菌为半子囊菌纲内孢霉目酵母科酵母菌属[1]，是一种单细胞真核微生物[2]。在发酵工业中，由于培养基种类繁多，培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要影响，因此优化微生物培养基就显得尤为重要[3]。

响应面法（Response Surface Methodology，RSM)优化培养基的实验设计步骤为：利用Plackett Burman（PB)实验筛选出几个重要的影响因素对其进一步研究[4]。用最陡爬坡实验以实验值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素效应值的大小确定变化步长，快速逼近最佳值区域[5]。通过BBD（Box Benken Design)或CCD（Central Composite Design)方法确定实验点，利用统计分析软件，确定最佳的实验条件及各因素间的相互作用。

黄丽金等[6]采用PB设计筛选出德氏乳杆菌保加利亚亚种LB14的生长强化因子为番茄汁、胡萝卜汁以及关键因子——培养基的初始pH值。以旋转中心组合设计及响应面法确定生长强化因子的最佳浓度及培养基的初始pH值。采用优化培养基培养，LB14的菌体浓度达到1.1×109cfu/mL，比优化前的2.4×108cfu/mL提高了近5倍。

吕国英等[7]采用PB设计评价影响香菇多糖产量主要因素为葡萄糖、鱼粉和KH2PO4；用最陡爬坡路径逼近3个因素的最大响应区域，通过Box-Behnken设计及响应面分析确定了主要影响因素的最佳浓度。结果表明，优化后的培养基中，粗多糖产量为2.33 g/L，比初始培养基提高了1.91倍。

本实验以酵母菌为研究对象，以单因素实验为基础，运用PB法筛选影响酵母菌生长的主要因素。以筛选出的因素为变量，以酵母菌生物量为响应值，运用响应面对培养基进行优化，以期获得最佳的培养基配比，从而提升酵母菌的收获量。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌株及耗材：分离自阿克苏红富士苹果皮的酵母菌M19；阿克苏红富士苹果；蛋白胨、葡萄糖、牛肉膏、磷酸氢二钾、氯化钠、酵母粉、氢氧化钠等均为分析纯。

V2200型分光光度计，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；Hi2211型酸度计，意大利哈纳仪器公司；HPX-9162 MBE型电热恒温培养箱、SWCJ-2FD型洁净工作台，上海博迅实业有限公司；LDZX-50KB型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；EL204-IC型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海)有限公司；CX21FS1-2型生物显微镜，日本奥林巴斯光学工业株式会社；JYL-0051型榨汁机，九阳股份有限公司。

1.2实验方法

1.2.1菌种活化

将酵母M19接入YPD液体培养基中，活化3次后以3 %（106cfu/mL)的接种量接入到各培养基中，28℃培养24 h后测定菌体的生长量。

1.2.2 PB实验

本实验选取7个影响因素作为研究对象，PB实验设计表选用7因素，N=16次的实验表格，每组实验做3个平行，取平均值。分析实验结果，比较各因素对酵母菌生长量的影响。

1.2.3爬坡设计

根据PB实验结果中各个显著影响因素效应的大小来设定步长及变化方向，找出峰值，以逼近最佳响应区域。

1.2.4中心组合设计

根据爬坡实验结果，利用Design Expert软件的旋转中心组合法对主要影响因素进行3因素3水平响应面分析设计。每个实验重复3次，取平均值。

1.2.5统计与分析

运用Design expert软件对实验结果进行拟合，并对拟合方程做显著性检验及方差分析。

1.2.6验证实验

比较M19在普通YPD培养基和响应面法优化的培养基中的生长量从而评价优化后的培养基。

2　结果与讨论

2.1 PB实验

根据实验室及相关研究结果[8]，本实验选取7个因素，蔗糖（X1)、蛋白胨（X2)、酵母粉（X3)、磷酸氢二钾（X4)、氯化钙（X5)、苹果汁（X6)、马铃薯汁（X7)作为研究对象，PB实验选用7因素，N=16次的实验表格，影响因子及编码见表1。利用Design expert软件分析实验结果，比较各因素对酵母菌生长量的影响，筛选主要影响因素。

各影响因素主效应分析结果见表2，从表2可以看出，7个因素中对响应值（酵母菌菌数)影响的顺序依次为苹果汁、蔗糖、蛋白胨、马铃薯汁、酵母粉、氯化钙、磷酸氢二钾。因此将马铃薯汁、酵母粉、氯化钙、磷酸氢二钾这4个显著性较低的因素设定在一个较好的水平上，选择苹果汁、蔗糖、蛋白胨这3个因素进行下一步实验。

表1 N=16的PB实验设计及结果

表2 PB实验设计因素水平及显著性检验

2.2爬坡实验

由PB实验可知（表2)，在酵母菌M19培养过程中，蔗糖因素产生了显著影响，具有正效应，应增加；苹果汁和蛋白胨都为负效应，应减少[9-10]，根据这2个因素效应大小的比例设定它们的变化方向及步长进行实验，设计及结果见表3。

2.3响应面实验

由最陡爬坡实验（表3)可知，第5组实验时酵母菌菌数获得最大值，因此选定实验5的水平作为响应面的实验中心点[11]。利用Design Expert软件中旋转中心组合对酵母菌培养基进行3因素3水平响应面分析，因素水平及实验结果见表4及表5。表5中的15个实验点可以分为两类：一是零点，为区域的中心点，零点实验重复3次，用以估计实验误差；二是析因点，共有12个析因点，自变量在X1、X2、X3所构成的三维顶点取值。

表3 爬坡实验设计及结果

表4 响应面因素水平表

表5 实验方案与结果

2.4数据分析

根据表5的实验结果利用Design Expert软件对下表进行多元回归分析，经回归拟合后，实验因子对响应值的影响可以得到二次多项回归方程：

式中：Y代表酵母菌菌数[Log（cfu/mL)]；Xa、Xb、Xc分表代表苹果汁、蔗糖、蛋白胨。各项系数的绝对值大小反映各因素对响应值的影响程度，系数的正负反映影响的方向[12]。

由该模型的方差分析（表6）可以看出，失拟项的P= 0.2575＞0.05，不显著，说明本实验无其他显著影响因素，实验模型的失拟度好，可以用该模型分析预测酵母菌菌数[13]。模型的P值小于0.01（P=0.0001)，说明模型极显著；用上述回归方程来反映各因子与响应值之间的关系，其自变量和因变量之间的线性关系是显著的。

表6 二次多项回归模型方程方差分析

表7 二次多项回归模型方程系数显著性检验

由表7可看出，Xb因素对酵母菌生长量的线性影响是显著的，Xa2、Xb2、Xc2对酵母菌菌数的曲面效应亦显著；交互项中的XaXb对酵母菌菌数的交互效应影响显著[14]；其余影响不显著，可以忽略，可得出回归方程：

根据上述回归方程作出的响应面分析图见图1。

图1为苹果汁与蔗糖的等高线图，因等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则与之相反[15]，从其等高线图可以看出此两因素的交互作用显著。由图1可知，当蛋白胨的量达到最好时（12 g/L)，苹果汁的水平点为中心点24 mL/L时，在实验范围内随着蔗糖量的增加，酵母菌菌数不断增长，且曲线较陡，说明蔗糖量的变化对酵母菌菌数的影响较大。当蔗糖的量增加到中心点附近时，酵母菌菌数达到最大；随着蔗糖量的进一步加大，酵母菌菌数减少，说明高浓度蔗糖对酵母菌的生长有抑制作用。当蔗糖含量在中心点56 g/L时，酵母菌菌数随着苹果汁的增加而增加，在中心点附近达到最大值。之后随着苹果汁量的增加，酵母菌菌数增长较平稳。

2.5验证性实验

为了验证优化培养基增菌效果的可靠性，用其进行了5个平行的验证实验，普通YPD培养基进行了3个平行的验证实验，验证实验培养基的菌数为8.8748 cfu/mL，而普通YPD培养基的菌数为8.5543 cfu/mL。

图1 响应面法（X1，X2)立体分析图

3　结论与总结

通过单因素实验，确定酵母菌（M19)最适生长温度及pH值，然后用PB实验评价影响酵母菌生长的主要因素，筛选出具有显著效果的3个因素分别为蔗糖、苹果汁、蛋白胨。在此基础上经最陡爬坡路径实验找出其峰值，逼近最佳相应区域后，对影响酵母菌生长量3个主要因素的最佳水平及其交互作用进行了研究和探讨，利用响应面法优化酵母菌培养基配方。最终得到最适培养基配方为蔗糖58 g/L、苹果汁22 mL/L、蛋白胨12 g/L、马铃薯汁10 mL/L、酵母粉10 g/L、氯化钙0.1 g/L、磷酸氢二钾1 g/L、温度28℃，培养基pH4.5条件下培养3 d，酵母菌的生长量为8.8748 cfu/mL。优化后的培养基与传统的YPD培养基（8.5543 cfu/mL)相比，酵母菌菌数提高明显。

参考文献：

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[2]白晓婷.酵母类产品在饲料中的研究与应用[J].中国饲料，2005(2)：8-10.

[3]刘志祥，曾超珍.响应面法在发酵培养基优化中的应用[J].北方园艺，2009(2)：127-129.

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[6]黄丽金，陆兆新，袁勇军.响应面法优化德式乳杆菌保加利亚亚种增殖培养基[J].食品科学，2005，26(5)：103-107.

[7]吕国英，张作法，潘慧娟，等.响应面分析法优化香菇多糖发酵培养基[J].食品科学，2010，29(1)：106-112.

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茅台2016年一季度各项指标均超两位数增长

本刊讯：据《新华网》报道，从2016年3月14日召开的贵州全省白酒产业座谈会上获悉，贵州茅台集团在2016年一季度实现了超级旺季的销售业绩，各项指标均超过两位数的增长。

茅台一季度各项指标暴涨，预计一季度，茅台集团可完成增加值130亿元左右，同比增长37 %以上，占全年计划398亿元的32 %；实现销售收入150亿元左右，同比增长41 %，占全年计划436亿元的34 %；实现利润总额75亿元左右，同比增长约26 %，占全年计划231亿元的32 %。

2016年茅台集团的总体目标是完成工业增加值398亿元，同比增长5 %左右；完成白酒产量7.8万吨，其中茅台基酒4万吨；完成白酒销量7.5万吨，同比增长10 %以上；实现销售收入436亿元，同比增长4.2 %；实现利润总额231亿元，同比增长1.7 %，实现税金165亿元左右。（江源荐，骆佳龙编辑）

来源：新华网2016-03-18

Optimization of Yeast Culture Medium by Response Surface Method

NIU Xiyue1,2, REN Xiaopu1,2, YE Lin1,2, LAN Hongzhu1and XU Qian1,2
（1.College of Life Sciences, Tarim University,Alar, Xinjiang 843300；2. Key Lab of Deep-processing of Special Agricultural Products,Alar, Xinjiang 843300, China)

Abstract:In order to evaluate the effects of culture medium compositions（carbon source, nitrogen source, growth factors etc.) on the growth rate of yeast, the main influencing factors were determined by Plackett-Burman design. On the basis of the most steep climb path experiment, the peak values of those factors were determined and those factors were then optimized by response surface method as follows: sucrose 58 g/L, apple juice 22 mL/L, peptone 12 g/L, potato juice 10 mL/L, yeast powder 10 g/L, calcium chloride 0.1 g/L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g/L, and the growth rate of yeast was 8.8748 cfu/mL after 24 h culture at 28℃and pH 4.5. Compared with traditional YPD culture medium （8.5543 cfu/mL), yeast quantity in the optimized culture medium increased by 2 times.

Key words:yeast; culture medium; PB design; response surface method

通讯作者：许倩，E-mail：xuqiantaru@126.com。

作者简介：牛希跃（1978-），男，硕士，实验师，研究方向为农产品加工，E-mail：hljnxy@126.com。

收稿日期：2015-12-23

基金项目：兵团工业科技攻关项目（2014BA026）；南疆特色农产品深加工兵团重点实验室开放课题（AP1503）；国家自然科学基金项目（31260393）。

DOI：10.13746/j.njkj.2015476

中图分类号：TS261.1；TS262.3；Q93-3

文献标识码：A

文章编号：1001-9286（2016)04-0047-04

优先数字出版时间：2016-02-02；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160202.1326.002.html。