高效液相色谱—电化学法测定大鼠脑脊液中多巴胺含量的研究

黄小莹++张黎君

摘 要：目的：研究高效液相色谱-电化学法测定大鼠脑脊液中多巴胺含量。方法：高效液相色谱运用Waters Atlantis T3作为色谱柱，且将乙腈-缓冲液（20：80）作为流动相，其pH=5.4，其相应流速则为0.32 mL·min-1。就氟哌啶醇（第一代）和利培酮（第二代）相应抗精神病药，针对大鼠伏隔核（NAC）及前额叶皮层（mPFC）当中多巴胺释放所具有的影响予以比较分析。结果：mPFC中多巴胺含量当给与氟哌啶醇之后，均未发生较大变化，而多巴胺在NAC当中含量则出现明显升高状况；当将利培酮给与之后，多巴胺含量在NAC及mPFC当中均存在明显升高状况。结论：高效液相色谱-电化学法稳定、灵敏及准确，对于脑微透析样品当中相应多巴胺具体的定量分析更为适用。就第二代抗精神病药物（利培酮）而言，其可能利用将前额叶皮层相应多巴胺水平予以升高方式，就认知功能及阴性症状给与改善。

关键词：高效液相色谱-电化学；大鼠脑脊液；多巴胺

中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）12-0068-02

多巴胺最为人体中枢神经系统当中十分重要的神经递质，而帕金森病及精神分裂症发病因素则为脑内多巴胺神经功能失调，为此，就准确、灵敏及快速分析方法予以建立，并对其浓度予以测定，则对药物治疗、疾病诊断及神经生理学研究均具有重要临床意义[1]。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究所选用试剂为甲酸和高氯酸、复方氯化钠注射液、氟哌啶醇注射液、利培酮粉末、乙二胺四乙酸、无水柠檬酸、谷胱甘肽及盐酸多巴胺等；所选用仪器为微透析探针和套管、Waters Atlantis T3色谱柱、脑立体定位仪、SCl-10A系统控制器、DGU-12A在线脱气机、岛津LC-20AD泵及手动进样器等。所选动物为雄性大鼠，平均体重为（259±19.8）g。

1.2 方 法

将所选取相应透析样品，经量取出相应20 μL，而后将其在存有200 μL PCR相应离心管予以放入，而后将5 μL多巴胺稳定剂加入，当完成混匀后，运用微量注射器实施取样操作，剂量为20 μL。采用生理盐水对氟哌啶醇注射液实施稀释操作，且将其浓度调和至1 mg·mL-1；采用利培酮，且其中融入中性酒石酸0.1mol·L-1，实施熔解操作，而后将药物溶液予以配置，其浓度则为1mg·mL-1。

此外，选取14只SD雄性大鼠，将其依据随机方式划分为三组，各为利培酮组、氟哌啶醇组及空白组。首先麻醉大鼠，并就脑区mPFC给与定位，此外，还需将NAC给与定位，而后将探针引导管埋置于脑区内，且于清醒动物装置中将大鼠予以妥善放置，当于区间3～5 d恢复后，在大鼠皮下，将给药管予以埋置，将插入探针及B030802均插于引导管处，在针入口处，将微量注射泵予以接入，而于出口处，则将接样管实施接入操作，且对灌流速度予以控制，即为1.4 μL·min-1。采用Ringer's实施液灌流操作，当完成2 h平衡之后，各于30 min，将1份透析液给与收集，且基础值则为3样品，当完成皮下注射且给药之后，对其中3 h样品给与收集，并采用上述方法实施样品检测[2-3]。

2 结 果

2.1 线性关系考察

就多巴胺储备液给与精密量取，而后采用高氯酸溶液 0.1 mol·L-1，将其与100 nmol·L-1实施结合稀释操作，而后采用Ringer's液，将上述溶液分别给与0.2、0.5、2、5及20 nmol·L-1等稀释操作，并依据上述检测方法实施检测。当纵坐标为测物峰面积Y，且横坐标为待测物浓度X，则运用加权（1/X2）最小二乘法，开展回归运算操作[4]，便可将标准曲线相应回归方程予以得出：

Y=1.977×105X-1.401×104（r=0.9997）

而多巴胺则于0.2～20 nmol·L-1之间，具有良好的线性关系，依据信噪比S/N=3，就检测限予以计算，则为0.05 nmol·L-1；依据S/N=10，对定量限给与计算，则为0.1 nmol·L-1。

2.2 精密度与回收率

依据上述配置方法，分别就浓度划分为低、中及高且各为0.5、2.0及10.0nmol·L-1相应质控溶液予以配置，且需各自配置5份，其依据上述操作步骤，实施5次日内连续进样操作，且连续3d实施日间测定，依据相应随行标准曲线，将各个质控样品所具有浓度予以求出，且将日间及日内相应精密度进行计算，就样品相应回收率予以计算，见表1。

2.3 大鼠mPFC及NAC中利培酮及氟哌啶醇对其内多巴 胺释放影响分析

依据上述操作方法，于大鼠皮下，分别将RISP及HAL各为1mg·kg-1，分别于前后顺序就NAC及mPFC当中各个时间点，在具体的透析液当中所存在的多巴胺水平，所存在的相应变化率，如图1所示。

从中可知，mPFC中多巴胺含量当给与氟哌啶醇之后，均未发生较大变化，而多巴胺在NAC当中含量则出现明显升高状况（1.6倍）；当将利培酮给与之后，多巴胺含量在NAC及mPFC当中均存在明显升高状况，及分别为后者的2.5倍及1.6倍。

3 讨 论

多巴胺作为一种极性较强的物质，通常情况下，其反相色谱柱，对其具有较弱的保留行为，所以，通过对Wasters Atlantis T3色谱柱给与选择，具有较好的分离效果。此外，在Ringer's溶液当中，多巴胺存在不稳定状况，而在本次实验当中，将抗氧剂加入至多巴胺 Ringer's溶液之后，对其进行观察可知，多巴胺具有较好的稳定性。针对流动相中水相而言，其相比于有机相比例，则对于多巴胺峰位具有较为显著的影响，伴随水相比例相应升高状况，则多巴胺在具体峰位方面则会出现向后移动状况，此外，其还对杂质峰具有较小的影响。就流动相的pH而言，其也会影响于样品峰的位置。特别是一些相应杂质峰所具有的峰位，则其具有较大的影响[5]。如若pH>4.3，则在具体的脑透析液当中，杂峰就会出现于多巴胺峰附近，对测定形成干扰。如若其值处于小于4.3或之下状况，则该峰则会出现快速前移状况，而多巴胺峰峰位则变化不明显，在有效分离方面可实现。精神分裂症的发病，往往和中脑边缘系统当中，相应多巴胺在具体的功能方面出现紊乱，存在相关性，而对于精神分裂症状况下所存在的认知障碍及阴性症状，则和mPFC在多巴胺功能方面出现不足相关。

通过本次研究可知，利培酮（非典型抗精神病药），对于mPFC当中多巴胺相应释放具有明显增加状况，可能和其能够对认知障碍及阴性症状予以改善相应机制有关，而氟哌啶醇则无法达到此功效。

参考文献：

[1] 宋宁宁.高效液相色谱—电化学检测法测定尿中多巴胺的含量[J].中国职业医学，1999，（4）.

[2] 吕允凤.应用微透析技术和高效液相色谱法测定川芎嗪对大鼠脑内多巴胺释放量的影响[J].药学学报，2013，（6）.

[3] 景富春，刘小莉，陈虹.HPLC-ECD法测定大鼠脑微透析液中的多巴胺及其代谢产物[J].中国临床药理学与治疗学，2006，（9）.

[4] 张向晖，刘军，苏林雁.库仑阵列电化学高效液相色谱法测定大鼠脑组织中单胺类神经递质及代谢产物[J].医学临床研究，2007，（1）.

[5] 谭炳炎，郑琳，冯翔.高效液相色谱/电化学法测定大鼠血液和脑组织中单胺类物质的含量[J].分析测试学报，2006，（2）.