拟南芥低钙诱导cDNA文库的构建

高 天，铁 英，王 妍 ，祁 智

（1.内蒙古大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010021；2.内蒙古和盛生态科技研究院有限公司，内蒙古呼和浩特 010021）

拟南芥为十字花科植物，广泛分布于欧亚大陆和非洲西北部。拟南芥作为一种模式植物，具有其他植物无法替代的优点：生长周期短（从发芽到开花28～42 d）；基因组小（约为12500万碱基对，包含约2.6万个基因，编码约2.5万种蛋白质），基因组仅由5对染色体组成，是目前已知植物基因组中最小的；拟南芥植株较小，在有限的空间内可大量种植；结实多（每株植物可产生数千粒种子）；遗传转化操作简单，易获得突变体；自花授粉植物，基因高度纯合；基于上述优点，拟南芥成为植物分子遗传学研究的模式材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”，广泛用于植物生命奥秘的研究探索[1-3]。

钙是植物生长发育所必需的营养元素，在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。钙是细胞壁的重要组分，能够维持细胞膜及膜结合蛋白的稳定性，调节细胞pH值，稳定细胞内环境。钙离子作为胞内胞外信号分子参与多种信号途径，许多刺激（包括盐胁迫、氧化胁迫、低温、高温和干旱等）均能引起胞内Ca2+水平改变，从而调控植物对刺激做出响应。因此，通过对钙的研究，有助于更好地揭示植物适应其生存环境的机制[4-9]。

cDNA文库的构建是研究生物体功能基因组的主要技术手段。它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因，并直接用于该基因的表达。由于传统cDNA文库中克隆片段短、无效克隆多和全长率低，因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。而全长cDNA文库包含大量完整的阅读框架，能高效地和大规模地获得基因序列，这些序列大多数拥有5′和3′端非编码区序列，因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷，成为目前基因克隆的一种重要方法，为蛋白质互作、表达和功能研究提供了更多和更可靠的信息，这对于基因组庞大，近期内还不能进行全基因组测序的生物来说，更是进行基因组研究的有效途径。目前有6种构建全长cDNA文库的方法，包括 Oligo-Capping、CAPture、SMART、CAP-trapper、Cap Select、CAP-jumping。这几种方法在起始材料用量、文库构建技术、实验操作复杂程度和文库构建质量等方面存在不同程度的优缺点。但综合比较而言，SMART和CAP-trapper这两种方法比较有实际应用价值。SMART法由Clonetech公司创建，文库构建是在酵母中进行的，借助生物体自身的同源重组功能将cDNA克隆到pGADT7-Rec中。首先，使用SMART cDNA合成技术合成含有与pGADT7-Rec载体末端同源的cDNA，然后，将cDNA和pGADT7-Rec共转入酵母菌株Y187中，通过同源重组构建cDNA文库，最后将所有克隆收集并分装成1 mL的文库用于双杂交筛选。无须使用大肠杆菌克隆、扩增和筛选文库。利用SMART cDNA合成技术，能够从低至100 ng的总RNA起始cDNA文库的构建，减少原始材料mRNA用量，无须酶切，实验快速、简单，建成文库的全长比例较高。本研究采用SMART cDNA合成技术成功构建了拟南芥低钙诱导的cDNA文库，为筛选与研究钙相关基因奠定了基础[10-13]。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物材料 哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia），本实验室保存。

1.1.2 菌株及质粒 酵母菌Y187、pGADT7-Rec购自Clontech公司。

1.1.3 主要试剂 Trizol、苯酚、氯仿、DEPC，Make Your Own“Mate＆PlateTM”Library System User Manual（Cat.No.630490） 购 自 Clontech公 司 ，Advantage 2 Polymerase Mix（ Cat.No.639201）购自Clontech 公司，Recombinant DNase I（RNase-free）试剂盒、Premix Taq购自TaKaRa公司。

1.2 试验方法

1.2.1 MQA培养基 MQA CK培养基配比见表1，MQA 0Ca培养基配比见表2。

表1 MQA CK培养基①

表2 MQA 0Ca培养基①

1.2.2 低钙诱导拟南芥 首先将拟南芥消毒播种到MQA CK培养基上，当根长到2 cm时将幼苗移到MQA 0Ca培养基上，低钙处理4 d，所有幼苗提取总RNA。

1.2.3 总RNA的提取[14-16]利用Trizol提取植物RNA，具体实验方法如下：（1）将适量的液氮盛于研钵中，充分预冷研钵，直至液氮不沸腾四溅，将收集好的植物放入液氮中（保证液氮或粉末氮浸过根即可）。（2）加入液氮后，用杵将植物捣成碎块，待液氮挥发至仅能盖住研钵底部时，迅速研磨，及时补加液氮，研磨过程重复2～3次。（3）将准备盛放研钵粉末的离心管在液氮中预冷：顺序为管底-管壁-管口（不要将管体与管盖连接部分伸入液氮中，以免断裂）。（4）用经过液氮充分冷却的离心管从研钵中挖取粉末（1.5 mL离心管粉末体积小于50 μL），迅速加入1 mL Trizol提取液，加入提取液时冲击离心管底部粉末，并迅速在振荡器上混匀（使提取液在30 s内溶解RNA，以便保护RNA）。确保粉末在融入Trizol之前不融化（粉末与提取液的体积比约为1∶10到 1∶15），室温放置不少于 5 min。（5）1000×g，4 °C离心30 min，离心时间长一些，可以使RNA同其他沉淀分离得更好，在RNA相内污染更少。（6）取80%左右的上清液倒入一个新的离心管内，加入1/5体积的氯仿，充分涡旋振荡。（7）1000×g，4 °C 离心15 min。这是检测RNA提取是否有可能成功的关键。（8）取80%上清液倒入一个新的离心管。注意避免吸取中间层物质。加入等体积的在-20℃保存的异丙醇，充分涡旋振荡。-20 °C 静置 1 h。（9）1000×g，4°C离心20 min，弃上清。（10）用1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）。充分涡旋振荡，使RNA沉淀完全破碎，只有这样才能达到用乙醇溶解盐的目的。1000×g，4 °C 离心 10 min。（11）缓慢倒掉大部分上清，倒置离心管在灭菌的滤纸上，吸净残液。室温干燥 5～10 min。（12）加 20～30 μL RNase free H2O 回溶。（13）取5 μL电泳，观察带型。高压电，时间控制在10 min以内。（14）RNA中残余DNA的去除参照Recombinant DNase I（RNase-free）试剂盒。

1.2.4 cDNA的合成 按照Advantage 2 PCR Enzyme System User Manual和 Make Your Own“Mate&Plate”Library System User Manual说明书进行操作。

cDNA整个合成过程包括三步：

第一步，第一链cDNA的合成。（1）准备：高质量总RNA；（2）在离心管中混匀试剂RNA样本2.0 μL（0.1～2.0 μg 总 RNA），CDSIII/6 引物 1.0 μL，ddH2O 1.0 μL，在做对照实验时，请使用 1.0 μL（1.0 μg）的对照总 RNA，CDSⅢ/6=随机引物；（3）72 °C，孵育 2 min；（4）冰上冷却 2 min，然后 14000 r/min，10 s，瞬时离心；（5）混合表3所示试剂，再将该混合液加入（4）中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。（6）25 °C，10 min，室温孵育。（7）42 °C，10 min，孵育。注意：孵育在热盖PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。（8）加入 1 μL SMARTⅢ-modified oligo，混匀，42 °C，1 h 孵育。（9）75 °C，10 min终止第一链合成反应。（10）室温冷却，加入1 μL RNase H（2 units）。37 °C，20 min，孵育。继续进行LD-PCR扩增。注意：若现在不立即进行后续实验，请将第一链合成反应管保存于-20°C冰箱，最长可保存90 d。

第二步，长距离PCR（LD-PCR）扩增双链cDNA[19-23]（1）准备：第一链cDNA、预热的PCR仪。（2）建立两管100 μL的扩增体系（表4），一个是实验组，另一个是对照组。（3）PCR 程序：95 °C 30 s，x Cycles，a，95 °C 10 s，68 °C 6 min，b，68 °C 5 min，a表示参考表5设定PCR循环数，b表示扩增程序每过一个循环时延伸时间增加5 s。例如，在第二轮循环中，延伸时间应该是6 min和5 s，在第三轮循环中，延伸时间应该是6 min 和10 s，如此叠加（表5）。（4）取5 μL PCR产物琼脂糖凝胶电泳进行分析。

表3 第一链cDNA合成反应体系 μL

表4 PCR反应体系 μL

第三步，CHROMA SPIN TE-400柱子纯化ds Cdna，按照 CHROMA SPIN Columns User Manual说明书进行操作。使用CHROMA SPIN TE-400纯化柱分选分子量大于200 bp的DNA。

表5 RNA起始量与PCR循环数的关系

1.2.5 酵母双杂交文库构建 第一步，准备：按照YeastmakerYeastTransformation System 2 User Manual说明书制备酵母菌株Y187感受态细胞；20 μL ds cDNA（ds cDNA 的量在 2～5 μg）；SD 固体培养基：SD/-Leu固体培养基（100×150 mm板）、SD/-Leu固体培养基（10×100 mm板）；YPDA/25%甘油（冷冻剂）；无菌的玻璃珠酵母菌株（5 mm）[24-27]。

第二步，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual说明书制备酵母菌株Y187感受态细胞。（1）从平板上或保种管中，挑少许酵母，在YPDA平板上划单克隆，30°C培养3 d左右。（2）从平板上分别挑取单克隆（直径2～3 mm）到含有3 mL YPDA的玻璃试管中（平行做3管）。（3）30 °C，250 r/min，培养 8～12 h。（4）取 200 μL 菌液，测OD600。（5）选取OD600值最大的一个试管（即活力最高的一个），吸取5 μL转移至50 mL新鲜的YPDA培养基中（培养基装在250 mL三角瓶中），30 °C，230 r/min，培养 16～20 h，直至 OD600=0.15～0.30。（6）将培养好的菌液转入2个50 mL离心管，室温离心，）（700～1000）×g，5 min，弃上清，用100 mL新鲜的YPDA悬起管底的菌体，并倒入干净的三角瓶中。（7）30 °C，230 r/min培养直到 OD600=0.4～0.5（3～5 h）。（8）将菌液倒入2个50 mL 离心管，室温离心，（700～1000）×g，5 r/min，弃上清，每个离心管用 30 mL ddH2O重悬。（9）再次离心，（700～1000）×g，5 min，弃上清，每管用1.4 mL 1.1×TE/LiAc重悬。（10）将重悬的菌液转移到2个2 mL离心管中，12000 r/min，15s。弃上清，每管用600μL1.1×TE/LiAc重悬，将两管重悬菌液并入一管，准备进行转化（立即使用，不要在冰上保存）。

第三步，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual说明书向酵母菌株Y187感受态中共转化下列组分：20 μL ds cDNA（2～5 μg）、6 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/μL）。（1）取一支洁净 15 mL离心管，置冰上，加入20 μL预先变性的Yeastmaker Carrier DNA，100 ℃煮沸5 min 后，立即冰浴。（2）加入 20 μL ds cDNA、6 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/μL），轻轻混匀。（3）加入600 μL酵母感受态细胞，轻轻混匀。（4）加入 2.5 mL PEG/LiAc，轻轻混匀后，30 ℃孵育45 min，期间每隔15 min轻轻混匀一次。（5）加入 160 μL DMSO，轻轻混匀后，42 ℃孵育 20 min，期间每隔 10 min 轻轻混匀一次。（6）700×g，离心 5 min，弃上清。（7）用3 mL YPD plus Liquid Medium重悬细胞，30 ℃，240 r/min 孵育 90 min。（8）700×g，离心5 min，弃上清，重悬于 15 mL 0.9%NaCl溶液中。（9）取100 μL转化液涂布于10 cm SD/-Leu平板上，涂2个板，其中转化液按 1∶10 和 1∶100 稀释。（10）30 ℃倒置培养3～4 d，直至菌落出现。

第四步，确定文库的库容，独立克隆数=No.of cfu/mL on SD/-Leu x重悬液体积（15 mL），这个值表示转化效率。若建立2×107库容的文库，那么在1/100稀释板上应当有133个独立克隆。若这时候有1×107个独立克隆，则可以直接进行下一步。

第五步，将剩下的悬浮液铺板于150 mm SD/-Leu选择培养基上，每板150 μL悬浮液，约使用100板，30°C 孵育3～4 d。

第六步，收获上一步中的转化子，（1）4°C ，3～4 h冷却培养板。（2）加入 5 mL 的冻存液。（3）使用无菌的玻璃珠将板中的菌落分离下来（缓缓地摇晃培养板，玻璃珠均匀地滚动于培养基表面将分离菌落，分离后的菌落溶于冻融液中）。（4）将所有的液体收集于无菌的单管中。（收集后的体积要达到0.5 L）。（5）用血球计数板来计算细胞密度。若细胞密度小于2×107cfu/mL，离心来减少悬浮液的体积。（6）将文库1 mL分装几管待短期使用，剩下的50 mL分装待长期使用，-80°C贮存。注意：当复苏贮存文库时，每次务必重新计算文库的滴度，确保文库滴度大于1×107cfu/mL。

1.2.6 菌落PCR鉴定cDNA文库质量 从上述1/100稀释板上随机挑选24个单菌落进行菌落PCR。将挑取的单菌落溶于40 μL ddH2O中，于液氮中冷冻7 min，然后沸水浴7 min，如此反复 3 次，取 4 μL 酵母菌液进行酵母菌落PCR（注意：吸取酵母菌液之前将菌液用移液器吹打均匀）。

所用引物为：5'LD primer：CTATTCGATGATGA AGATACCCCACCAAACCC，3'LD primer：GTGAACT TGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT。 PCR反应体系Premix Taq25 μL，5'LD primer（10 umol/L）0.5 μL，3'LD primer（10 umol/L），菌液 4 μL，加 50 μL ddH2O至总体积反应程序98°C变性5 min，98°C变性 10 s，59 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 3 min，35 个循环，72 °C 后延伸10 min，15 °C 1 h。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

取经低钙诱导处理的拟南芥幼苗，液氮研磨，提取总RNA。经测定，OD260/OD280=1.95，RNA浓度为1.22 μg/μL，表明 RNA 纯度较高，无蛋白质及其他盐离子等杂质的污染。琼脂糖凝胶电泳结果分析，28 S和18 S电泳条带清晰，表明RNA质量较好。综上所述，RNA质量及完整性较好，可以用来构建cDNA文库。

2.2 cDNA的合成

采用SMART方法合成cDNA第一条链，cDNA第二条链合成采用LD-PCR的方法，经电泳检测见图2，ds cDNA分布200～5000 bp，呈弥散状，表明cDNA质量良好，可用于cDNA的构建。

2.3 酵母双杂交文库构建及质量鉴定

经检测，文库滴度为3×109cfu/mL，文库总量为4.5×1010cfu。随机挑选24个酵母文库单克隆进行菌落PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测显示见图3，cDNA文库重组率为79.2%（4个pGADT7-Rec空载体，扩增片段大小291 bp，1个无扩增条带），重组片段大小在200～2700 bp，插入片段平均大小为760 bp。表明cDNA文库质量较好，适用于互作蛋白的筛选。

3 结论与讨论

钙是植物所必需的营养元素，在植物生长发育过程中起着非常重要的作用。近年来，钙的研究逐渐成为人类研究的热点。一方面，随着我国经济的快速发展，工业化进程的加剧，工业源SOx和NOx气体的排放导致的酸雨现象日益严重[28]。酸雨长期作用的结果是导致土壤酸化，进而导致土壤中阳离子特别是钙离子的流失[29]。当土壤中的钙离子含量降低时，植物所能吸收的钙含量也随之降低，导致植物缺钙，对植物的正常生长发育产生严重的影响。另一方面，尽管有的地方土壤含钙丰富，但果树和蔬菜缺钙十分普遍。此外，钙具有独特的信使作用，在植物体内参与多种生理过程的调节。因此，钙的研究不仅能够给人类带来巨大的经济效益，而且有利于自然的保护。

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一，cDNA便于克隆和大量表达，不像基因组含有内含子而难于表达，从cDNA文库能够筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达，是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。本研究采用SMART cDNA合成技术成功构建了拟南芥低钙诱导的cDNA文库。经检测，文库滴度为3×109cfu/mL，文库插入片段大小在200～2700 bp，插入片段平均大小为760 bp，阳性克隆率为79.2%，完全符合cDNA文库的基本要求，可以用来进行下一步的酵母双杂交筛选，有助于进一步诠释Ca2+在植物体内的调控机制。

参考文献：

［1］ 张振桢，许煜泉，黄 海.拟南芥——一把打开植物生命奥秘大门的钥匙［J］.生命科学，2006（5）：442-446.

［2］徐平丽，张传坤，孙万刚，等.模式植物拟南芥基因组研究进展［J］.山东农业科学，2006（6）：100-102.

［3］秦 川，张 媛.模式植物拟南芥的研究进展［J］.中学生物教学，2009（9）：6-8.

［4］Hepler P K.Calcium：a central regulator of plant growth and development［J］.The Plant Cell，2005，17（8）：2142-2155.

［5］Dominique（Niki）Robertson M，Adrian E，Collakova GT，et al.Modulating Plant Calcium for Better Nutrition and StressTolerance［J］.ISRNBotany，2013（2013），ID952043.

［6］Martins T V，Evans M J，Woolfenden H C，et al.Towards the physics of calcium signalling in plants ［J］.Plants，2013，2（4）：541-588.

［7］周 卫，汪 洪.植物钙吸收、转运及代谢的生理和分子机制［J］.植物学通报，2007（6）：762-778.

［8］White Philip J，Broadley Martin R.Calcium in plants［J］.Annals of Botany，2003，92（4）：487-511.

［9］Chidananda Nagamangala K，Mickael M，Andrea O，et al.Calcium Imaging Perspectives in Plants［J］.International Journal of Molecular Sciences，2014，15（3）：3842-3859.

［10］晏慧君，黄兴奇，程在全.cDNA文库构建策略及其分析研究进展［J］.云南农业大学学报，2006，21（1）：1-6.

［11］董志敏，张宝石，关荣霞，等.全长cDNA文库的构建方法［J］.中国农学通报，2006，22（2）：51-55.

［12］杨成君，王 军.cDNA文库的构建策略及其应用［J］.生物技术通报，2007（1）：5-9.

［13］刘太峰，孟庆峰，段小波，等.cDNA文库构建方法的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2012，39（7）：40-43.

［14］李 宏.植物组织RNA提取的难点及对策［J］.生物技术通报，1999（1）：38-41.

［15］吴凯朝，黄诚梅，李杨瑞，等.Trizol试剂法快速高效提取3种作物不同组织总 RNA［J］.南方农业学报，2012，43（12）：1934-1939.

［16］宗成志，左欣欣，严海燕.影响RNA提取质量的因素分析［J］.广西农学报，2011，26（1）：31-34.

［17］Chenchik A，Zhu Y Y，Diatchenko L，et al.Generation and use of high-quality cDNA from small amounts of total RNA by SMART PCR ［J］.Gene cloning and analysis by RT-PCR，1998：305-319.

［18］Zhu Y Y，Machleder E M，Chenchik A，et al.Reverse transcriptase template switching：A SMART approach for full-length cDNA library construction［J］.Biotechniques，2001，30（4）：892-897.

［19］Barnes W M.PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates ［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1994，91（6）：2216-2220.

［20］Cheng S，Fockler C，Barnes W M，et al.Effective amplificat ion of long targets from cloned inserts and human genomic DNA［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，1994，91（12）：5695-5699.

［21］KelloggD E，Rybalkin I，Chen S，etal.TaqStart： A Neutralizing Monoclonal Antibody that facilitates“Hot Start”PCR［J］.Clontechniques IX，1994，2：1-5.

［22］Kellogg D E，Rybalkin I，Chen S，et al.TaqStart Antibody：“hot start”PCR facilitated by a neutralizing monoclonal antibody directed against Taq DNA polymerase ［J］.BioTechniques，1994，16（6）：1134-1137.

［23］Nelson K，Brannan J，Kretz K.The fidelity of TaqPlus DNA polymerase in PCR ［J］.Strategies Mol Biol，1995，8：24-25.

［24］Guthrie C.Fink G R.Guide to yeast genetics and molecular biology［J］.Methods in Enzymology，1991，194：1-932.

［25］Heslot H，Gaillardin C.Molecular biology and genetic engineering of yeasts［M］.Boca Raton：CRC Press，1991.

［26］Fields S.The Two-Hybrid System to Detect Protein-Protein Interactions［J］.Methods，1993，5（2）：116-124.

［27］Fields S，Song O.A novel genetic system to detect proteinprotein interactions［J］.Nature，1989，340：245-247.

［28］吴飞华，刘廷武，裴真明，等.酸雨引起森林生态系统钙流失研究进展［J］.生态学报，2010，30（4）：1081-1088.

［29］Ling D J，Zhang J E，Ouyang Y.Advancements in research on impact of acid rain on soil ecosystem：a review［J］.Soils，2007，39（4）：514-521.