猪圆环病毒2型 GZ-ZYSY株全基因组的克隆与序列分析

王招弟，吴好叶，严莉娅，姜玉瑶，牟滕慧，曾智勇，代振江

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒2型 GZ-ZYSY株全基因组的克隆与序列分析

王招弟，吴好叶，严莉娅，姜玉瑶，牟滕慧，曾智勇*，代振江

(贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）

猪圆环病毒2型（PCV2）是目前严重危害养猪业的疾病之一，给我国养猪业造成了严重的经济损失[1]。崔亚兰等对2007—2011年收集的4 980份贵州各地区猪只血清样品进行PCV2抗体检测，发现阳性率为43.45%，且呈逐年上升趋势，对2011年收集的133份猪组织样品进行了PCV2病原核酸检测，发现其阳性率高达77.44%，说明PCV2在贵州省广泛流行且日益严重[2]。为丰富贵州PCV2全基因组序列库，了解贵州地区PCV2遗传变异情况，本研究从PCV2抗体检测为阳性的血清中克隆测序了一株PCV2全基因组序列，命名为GZ-ZYSY，并对其进行了生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 血清、质粒

血清系贵州遵义绥阳某猪场送检，PMD19-T Vector购自宝生物工程（大连）有限公司，大肠杆菌感受态TOP10由中国兽药监察所惠赠。

1.2 主要试剂

核酸提取试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ，LA Taq聚合酶，DNA DL2000 Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司；E. Z. N. A.TM Gel Extraction Kit (50) 胶回收试剂盒购自美国Omega公司；普通质粒微量提取试剂盒购自TIANGE公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计与合成

根据GeneBank公布的PCV2序列设计扩增PCV2全基因组序列且携带酶切位点的引物，引物序列如表1所示：

表1 本研究中所使用的引物

1.4 PCV2全基因组的扩增

用核酸提取试剂盒提取送检血清的混合核酸，以其为模板，用设计的引物对PCV2全基因组进行PCR扩增，体系和条件如下：模板8μL，dNTP 8μL，10×LA Buffer 5μL，LA Taq酶1μL，上下游引物各2μL，ddH2O 12μL。条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

1.5 目的基因的克隆和测序

将PCR产物进行电泳，90 V，40 min，用胶回收试剂盒回收纯化目的条带，将回收产物连接至PMD19-T，转化至TOP10大肠杆菌，涂板培育，挑取阳性菌落，抽提质粒，进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切与质粒PCR鉴定，将鉴定为阳性的质粒送至上海生工生物工程有限公司进行测序。

1.6 PCV2全基因组序列的生物信息学分析

用DNAStar对扩增的PCV2全基因组序列和GeneBank公布的目前市面上流行的主要PCV2疫苗株DBN-SX07-2（HM641752.1）、LG（HM038034.1）、SH（HM038027.1）、ZJ（AY686764.1）进行相似性分析。

2 结果

2.1 PCV2全基因组序列的扩增

以从血清中提取的混合核酸为模板，用设计的引物对PCV2全基因组序列进行扩增，将PCR产物进行电泳，显示目的条带为1 800 bp左右，与预期大小相符。电泳结果如图1。

2.2 PCV2全基因组序列相似性分析

根据2008年欧盟猪圆环病毒疾病委员会提出的PCV2分型标准可知[3]，GZ-ZYSY株属于PCV2a型，将GZZYSY株氨基酸序列与目前市面上流行的主要PCV2疫苗株DBN-SX07-2（HM641752.1）、LG（HM038034.1）、SH（HM038027.1）、ZJ（AY686764.1）进行相似性比较，结果如图2所示，各疫苗株中与GZ-ZYSY株相似性最高的是DBN-SX07-2（HM641752.1） 疫苗株，相似性为93.2%。多重比对结果如图3所示，GZ-ZYSY株与4株疫苗株的ORF2氨基酸序列相比存在23个氨基酸的差异。

图1 PCV2全基因组PCR扩增结果

图2 GY-ZYSY株与疫苗株的氨基酸序列的相似性比较

图3 GY-ZYSY株与疫苗株ORF2氨基酸序列的多重比对

3 讨论

本文从PCV2抗体阳性的血清中扩增获得了一株PCV2全基因组序列，序列分析发现其为PCV2a型，由此推测是否PCV2a型较PCV2其他基因型更能维持较长的病毒血症时间。氨基酸序列的相似性分析发现，GZ-ZYSY株与市面上流行的疫苗株中相似性最高的是DBN-SX07-2（HM641752.1）疫苗株，相似性为93.2%，各疫苗株之间的相似性在92%～99.7%之间。氨基酸序列多重比对发现GZ-ZYSY株与各疫苗株的ORF2之间存在23个氨基酸的差异，这些氨基酸差异是否会导致其与疫苗株之间抗原出现较大差异有待进一步研究。本研究丰富了贵州地区PCV2的基因组序列库，对贵州PCV2的防控提供了一定参考。

[1] 李玲，李国新，周艳君，等. 2008—2011年中国部分地区猪圆环病毒2型的分子流行病学调查[J].中国动物传染病学报，2012（2）：1-10.

[2] 崔亚兰，王开功，张华，等. 2007—2011年贵州省猪圆环病毒感染的流行病学调查[J]. 畜牧与兽医，2013，45（3）：70-73.

[3] CORTEY M，OLVERA A，GRAUROMA L， et al. Further comments on porcine circovirus type 2 ( PCV2) genotype definition and nomenclature[J].Vet Microbiol， 2011，149：522-523.

2016-09-14)

省校合作计划项目, 黔科合LH字[2014]7670号

王招娣（1993—），女，在读学士，研究方向：动物传染病病原分子生物学。

曾智勇（1978—），男，教授，博士，硕士生导师，从事动物传染病病原分子生物学研究