芜湖市规模鸡场禽流感抗体水平的监测与分析

张冬冬 ，季慕寅，徐　迪 ，张海燕，萧　晟，杨艳丽

( 1.芜湖职业技术学院　生物工程学院，安徽　芜湖　241003；

2.芜湖市畜牧兽医局，安徽　芜湖　241000 )



芜湖市规模鸡场禽流感抗体水平的监测与分析

张冬冬1，季慕寅1，徐迪1，张海燕1，萧晟1，杨艳丽2

( 1.芜湖职业技术学院生物工程学院，安徽芜湖241003；

2.芜湖市畜牧兽医局，安徽芜湖241000 )

摘要：目的：免疫接种是预防禽流感疫情的最主要措施，通过抗体检测判断免疫效果并指导后续免疫措施的改进，为芜湖市禽流感的综合防控提供了基础依据；方法：2013年～2015年期间对芜湖市部分规模鸡场进行血清学调查，采用间接ELISA法(酶联免疫吸附试验)进行检测，对禽流感抗体阳性率进行了分析；结果：(1)2013年至2015年间，芜湖市禽流感免疫情况整体良好，血清抗体阳性率平均达到81.9%，但2014年度春季免疫普查结果低于国家强制免疫要求；(2)抽检的90个养鸡场中，74个抗体阳性率超过国家免疫要求，养鸡场免疫合格率为82.2%；(3)芜湖四区四县中仅弋江区抗体阳性率结果低于国家免疫要求，各区县抽检的血样抗体阳性率差异极显著(P<0.01)；(4)三种类型养鸡场抗体阳性率存在差异极显著(P<0.01)，肉鸡场抽检的血样抗体阳性率较低，需针对性加强免疫措施；结论：禽流感抗体水平监测在芜湖市重大动物疫病的防控中起到了积极的预警和指导作用。

关键词：芜湖；禽流感；抗体；酶联免疫

禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其划为A类动物疫病，并被列入国际卫生武器公约动物类传染病名单[1]。禽流感病毒依据其外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同而有许多亚型，目前已从禽类鉴定出16个HA亚型(H1～H16)，9个NA亚型(N1～N9)，根据静脉接种致病指数(IVPI)可将禽流感病毒亚型划分高致病性禽流感、中致病性禽流感和低致病性禽流感，其中H5和H7两个亚型可以引起高致病性禽流感，以传播快、发病快、死亡率高为特征，也可传染哺乳动物甚至致人发病死亡[2]。我国从2004年起，在全国范围内对存栏禽类进行高致病性禽流感强制免疫[3]，由于影响免疫的因素较多，免疫后抗体水平仍然需要进行监测和分析，为配合芜湖市畜牧兽医局的重大动物疫病的免疫普查工作，芜湖职业技术学院动物保健中心于2013至2015年期间针对芜湖市部分规模化鸡场进行血清学检验，为芜湖市禽流感的有效防控提供基础依据。

1材料与方法

1.1血清采集

由芜湖市畜牧兽医局下辖各动物疫病监测站抽检，每份血样采集不少于0.5mL，并记录血样来源信息和编号，芜湖职业技术学院动物保健中心收集整理，剔除溶血严重样品，合格样本2000 r/min 离心10 min分离血清，-20℃保存待测[4]。

1.2主要仪器

Thermo MK3酶标仪，5424R离心机，国产高压蒸汽灭菌器、超净工作台、生化培养箱、冰箱。

1.3试剂盒和判定标准

禽流感通用型ELISA抗体检测试剂盒购自深圳康百得。采用间接ELISA法，操作程序按照试剂盒说明进行：样品血清1 ∶100稀释-抗原抗体孵育30min-洗板3次-酶标二抗孵育30min-洗板3次-显色反应10min-终止，抗原包被板上每份样品血清一孔，阳性血清、阴性血清、空白对照实验各两孔，以空白对照调零，酶标仪450nm检测波长下(630nm作为参比波长)读取各孔OD值。

结果按照试剂盒给出条件判定：(1)实验有效性判定，阴性对照孔OD值≤0.15、阳性对照孔OD值≥0.30，否则实验无效；(2)检验结果判定(S/P=样品OD值/阳性对照平均OD值)，在实验有效的前提下，若样品S/P≥1.1，判为禽流感病毒抗体阳性，若样品S/P≤0.9，判为禽流感病毒抗体阴性，若样品0.9

鸡场免疫合格判定：该鸡场抽检的血样抗体阳性率≥70%(国家免疫要求)，则判断该鸡场免疫合格。

2检测结果

血样检测结果按照年度、区县、养殖类别分别进行抗体阳性率汇总，统计结果使用软件SPSS 16.0进行R×C表卡方检验(养殖场免疫合格率差异分析采用Fisher's Exact Test数据结果，血清抗体阳性率差异分析采用Pearson Chi-Square数据结果)[5]。

2.1年度统计

2013年1月至2015年12月期间，为配合芜湖市畜牧兽医局春季防疫、秋季防疫的免疫普查工作，共检测芜湖市四区四县90个养鸡场的合格血样893份，结果详见表1。

各年度春防，秋防免疫普查中共抽检了90家养鸡场，其中74家养鸡场抽检血样的抗体阳性率≥70%，16家养鸡场免疫不合格(抗体阳性率<70%)。不同年度间养鸡场免疫合格率差异极显著(χ2=10.447，0.01

各年度春防、秋防抽检血样的抗体阳性率在50.6～96.7%，平均81.9%，年度间结果差异极显著(χ2=139.000，P<0.01)，其中2014年春防免疫普查抽检的血样抗体阳性率为50.6%，低于国家免疫要求。

表1　禽流感抗体检测年度统计

2.2区县统计

将血样按照来源划入镜湖、弋江、鸠江、三山四个市属辖区和芜湖、繁昌、南陵、无为四县，按照区域进行统计对比，结果见表2。

表2　禽流感抗体检测区县统计

结果显示，芜湖市属区县均存在少量养鸡场的免疫不合格，其中三山区抽检养鸡场免疫合格率最高达94.7%，南陵县最低为66.7%，但由于抽检的鸡场数目较少，各区县鸡场免疫合格率之间差异无统计学意义(χ2=5.814，P>0.05)。

按照各区县抽检的血样抗体阳性率统计，各区县抽检血样抗体阳性差异极显著(χ2=44.971，P<0.01)，各地抽检血样抗体阳性率在60%～91.5%，仅弋江区未达到国家免疫要求，抽检血样抗体阳性率为60%。

2.3养殖类别统计

在抽检的90家养鸡场中，共25家蛋鸡场、56家肉鸡场、9家种鸡场，将检测结果按照不同养殖类别进行统计，结果见表3。

结果显示，蛋鸡场的免疫合格率最高为92%，其次是种鸡场88.9%，最低为肉鸡场免疫合格率76.8%，由于各养殖类别单位抽检的数量较少，不同养殖类别养鸡场的免疫合格率差异无统计学意义(χ2=2.707，P>0.05)。

而以各养殖类别的血样抗体阳性率进行统计，蛋鸡禽流感抗体阳性率为91.0%，其次为种鸡89.5%，而肉鸡最低为76.7%，蛋鸡、肉鸡、种鸡抗体阳性率差异极显著(χ2=27.369，P<0.01)。

表3　禽流感抗体检测养殖类别统计

3结论与讨论

本研究使用的是鸡禽流感通用型ELISA检测试剂盒，检测结果并不能区分是哪种亚型禽流感病毒疫苗引发的抗体，也不能确定是疫苗还是禽流感病毒引发的抗体，芜湖市各规模养鸡场经调研发现，主要使用的是重组禽流感病毒H5亚型二价灭活苗、H7亚型二价灭活苗和H5+H9亚型二联灭活苗等，市场上虽然也有具体亚型禽流感病毒抗体检测试剂盒，但本研究重点考察疫苗的免疫后效果，并不强调病原检测和亚型抗体分类，故在考虑实验效率和实验成本的前提下，采用鸡禽流感通用型ELISA检测试剂盒，而并未采用其他方法如血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验、PCR法等。

年度统计结果显示，芜湖市禽流感整体免疫情况良好，6次春防、秋防普查中，5次整体抗体合格率超过国家免疫要求，但在2014年度春防免疫普查中，抽检15家养鸡场，其中7家养鸡场免疫不合格，其中弋江区1家，鸠江区、芜湖县、繁昌县各2家，7家养鸡场抽检血样的抗体阳性率为0%或极低，调查发现由于这7家养鸡场，疫苗免疫时间和检测时间间隔太短，抗体水平还未能显著升高，后期应重新对抗体水平进行检测评估。

区县统计结果显示芜湖市属四区四县大部分鸡场免疫合格，但各地均有少量鸡场免疫不合格。弋江区抽检血样的抗体阳性率为60%，未达到国家免疫要求，原因为弋江区仅抽检4家养鸡场共30份血清数量，其中1家养鸡场抽检了10份血样抗体检测全部阴性，调查发现这家养鸡场送检血样为初次免疫肉鸡，进行二次加强免疫即可提高抗体水平，所以结果并不能真实反映弋江区的禽流感免疫状况。南陵县抽检分属15家养鸡场的血样虽然抗体阳性率整体达到80.7%，由于其中10家养鸡场抗体阳性率近100%，而5家养鸡场免疫不合格，不足以抵御疫病风险，应当引起相关从业者和管理部门的重视，进一步调整免疫程序和疫苗选择，进行补免加强并及时监控免疫效果。

对蛋鸡、肉鸡、种鸡三种类型养鸡场进行统计分析，三种类型养鸡场都达到了国家免疫要求，肉鸡场免疫合格率和抗体阳性率均低于蛋鸡场和种鸡场，主要由于大部分蛋鸡场、种鸡场的规模化、集约化、管理水平较高，免疫程序科学合理，部分肉鸡场由于饲养周期短、免疫次数少，抗体阳性率水平较低，更有部分肉鸡场采用传统散养或半散养方式，免疫难度大，免疫程序的制定及执行存在一定的问题，需根据检测结果，迅速制定和落实相关免疫措施，预防疫病风险。

抗体阳性率在各鸡场分布极不平衡，部分鸡场禽流感的抗体阳性率可达100%，而免疫情况差的鸡场禽流感抗体阳性率低至为0%，免疫存在较大的差异，原因在于各鸡场的饲养管理、疫苗选择和免疫程序制定以及鸡群自身的健康水平差异较大。本研究通过抗体水平检测，及时反馈各养鸡场，并指导补免加强和后期监测，使得免疫不合格的鸡场的抗体阳性率均有大幅度提升，起到了良好的预警作用和指导作用，在2015年的春防、秋防检测中，禽流感的抗体阳性率，整体达到了90%以上。对于免疫情况良好的鸡场，也不能放松警惕，应当根据免疫抗体消长规律，间隔数月再次评估群体抗体水平，实现抗体水平监测的常态化。

除了疫苗自身质量原因以外，科学制定和严格执行免疫程序规定的接种方式、时间、次数、接种量、操作方式、药物影响[6]、盲目联合应用疫苗等[7]，以及疫苗的保管存放，也是免疫成败的关键。另外，某些鸡场疫苗接种时间和抗体检测时间接近，抗体未能产生，也是检测结果偏低的原因之一，应根据疫苗免疫规律，再次检测抗体水平，获得合理评估结果。

本研究通过血清学调查，统计了近年来芜湖市属各区县禽流感的抗体阳性率，并分年度、区县、养殖种类对检测结果进行分析，基本掌握了芜湖市禽流感的抗体水平分布情况，为禽流感的综合防控措施提供了基础依据，在本研究的警示和反馈指导下，芜湖市2015年抽检的养鸡场免疫合格率和血样抗体阳性率较往年有较大提高，对地方重大动物疫病的防控起到了积极作用。同时，本研究仅进行了禽流感抗体水平检测，未进行病毒抗原和抗体分型测定，在制定禽流感综合防控措施时，需在抗体和抗原检测的共同基础上，加大免疫和监测力度，并加强日常管理[8]，防范疫病风险，促进养殖业良性发展。

参考文献：

[1]甘孟候．禽流感(第2版)[M]．北京：中国农业大学出版社，2002．

[2]王伟，于飞凤，李佳．2010-2014年阿克苏市禽流感抗体检测与分析[J]．畜牧兽医杂志，2015，34(6)：90-91．

[3]陈华，陈静，田夫林，等．2009-2013年山东省H5亚型禽流感抗体检测[J]．山东畜牧兽医，2014，35(9)：3-5．

[4]熊江林，周华林，王长义，等．鄂西北地区规模化鸡场H9亚型禽流感抗体水平监测[J]．中国畜牧兽医，2010，37(12)：239-241．

[5]黄宝学，韦显凯，梁素联，等．鸡鸭免疫禽流感Re-6疫苗后的抗体监测[J]．中国动物检疫，2014，31(4)：67-70．

[6]贺绍君，刘德义，李静，等．环境应激对生长后期肉鸡免疫器官组织结构的影响[J]．安徽科技学院学报，2013，27(4)：5-9．

[7]蒋法成，陈树霞，孙浩，等．淮安市新城疫和禽流感抗体监测与免疫效果分析[J]．中国畜禽种业，2012，8(3)：130-131．

[8]龚争，肖磊，王旋，等．限饲日龄对肉鸡福利指标和免疫器官发育的影响[J]．安徽科技学院学报，2013，27(6)：6-10．

(责任编辑：马世堂)

Detection and Analysis of Avian Influenza Antibody in Large-scale Henneries of Wuhu City

ZHANG Dong-dong1, JI Mu-yin1, XU Di1, ZHANG Hai-yan1, XIAO Sheng1, YANG Yan-li2

(1.Department of Biology Engineering，Wuhu Institute of Technology，Wuhu 241003，China；2. Bureau of Animal Husbandry and Veterinary，Wuhu 241000，China)

Abstract：Immunization is the most important measure to prevent the outbreak of avian influenza. This paper studied antibody positive rate of bird flu in some large-scale henneries of Wuhu City by using Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay (ELISA) method during 2013 to 2015. The result showed that the overall situation of avian influenza immunization in Wuhu City was good from 2013 to 2015 during which serum antibody positive rate was 81.9%, but the 2014 annual spring immune census results is below the national mandatory immunization requirements. In the sampling of 90 chicken farms, 74 antibody positive rates were over the national immunization requirements, and the immunity percent of pass was 82.2%. The positive rate of serum antibody was significantly different among districts in Wuhu City (P<0.01), and only Yijiang District antibody positive rate was lower than the national immunization requirements. It also indicated the antibody positive rate of bird flu had significant differences in three types of henneries (P<0.01), that broiler farms need to strengthen immunization measures due to its lower antibody positive rate. This paper uses antibody detection to judge the immune effect and to guide the improvement of follow-up immunization measures which provided the basis for the comprehensive prevention and control of avian influenza in Wuhu City.

Key words:Wuhu; Avian Influenza; antibody; ELISA

中图分类号：S855.3

文献标识码：A

文章编号：1673-8772(2016)01-0025-05

作者简介：张冬冬(1983-)，男，安徽省定远县人，硕士，讲师，主要从事生化检测研究。

基金项目：芜湖职业技术学院自然科学研究项目(WZ[2012]ky04)；安徽省高等学校省级自然科学研究重点项目( KJ2016A765)。

收稿日期：2015-12-20