自拟中药免疫促进剂对SD大鼠白细胞及血清生化指标的影响

周金星，靳二辉，李升和，金光明

(1.安徽科技学院　动物科学学院，安徽　凤阳　233100；

2.安徽科技学院　细胞与分子生物学研究中心，安徽　凤阳　233100；

3.安徽科技学院　生命科学学院， 安徽　凤阳　233100)



自拟中药免疫促进剂对SD大鼠白细胞及血清生化指标的影响

周金星1,2，靳二辉1，李升和1，金光明3*

(1.安徽科技学院动物科学学院，安徽凤阳233100；

2.安徽科技学院细胞与分子生物学研究中心，安徽凤阳233100；

3.安徽科技学院生命科学学院， 安徽凤阳233100)

摘要：目的：观察自拟中药免疫促进剂对SD大鼠白细胞、血清生化指标的影响。方法：将黄芪、板蓝根、炒白术、茯苓、陈皮、山楂、甘草、山药等中药材按一定的比例混合后经水煮，醇沉后浓缩，每毫升药液相当于1g生药。取60只24日龄雄性SD大鼠，随机分为4组，分别为对照组、1.5mL/kg组、3.0mL/kg和6.0mL/kg，对照组正常饮水，其余试验组每天定时称重，并按1.5mL/kg、3.0mL/kg和6.0mL/kg体重折算剂量后定时灌胃，于灌胃后第10d、30d和60d通过心脏采血后，经血细胞分析仪及全自动生化分析仪，测定各种白细胞数量及血清生化指标。 结果： 结果表明，1.5mL/kg组可使血液中淋巴细胞数增加或显著增加，6.0mL/kg组可使白细胞总数及中性粒细胞数极显著减少，其余各种白细胞数变化不显著。至灌胃60d时，血清中UA、ALT、ALP和LDH含量极显著减少(P<0.01)，6.0mL/kg组TC含量极显著减少，其余生化指标在不同时间变化不显著。结论：自拟中药免疫促进剂可部分提高SD大鼠淋巴细胞数量，降低血清中UA、ALT、ALP和LDH含量，以1.5mL/kg剂量组最适。

关键词：免疫促进剂；白细胞；血清；生化指标；SD大鼠

免疫促进剂是一种用于调节机体免疫功能，增强机体免疫应答，维持机体免疫功能稳定并可以预防疾病发生的物质。但目前免疫增强剂种类有限，且多有不良反应等情况出现[1]，因此，研究开发具有调节免疫活性和增强机体免疫力的中草药免疫增强剂显得尤为重要。

目前，对于中草药免疫增强剂的研究，主要集中于单味中药与疫苗共同使用时的协同作用或复方中草药对机体的免疫促进作用，如单味中药黄芪能明显提高NP30免疫力[2]，灵芝能增加肿瘤坏死因子(TNF-α)的数量[3]，柴胡和甘草能增加小鼠IgG抗体的含量，增强免疫功能[4-5]，人参和丹参可以增强机体细胞因子或淋巴细胞的增值，提高机体的免疫力[6]；复方中药散剂能显著提高鸡新城疫HI抗体效价和免疫器官指数[7]，余树民等自拟中草药复方和黄芪多糖可显著提高免疫抑制模型小鼠白细胞及血清中的IgG和IgM含量，促进其血清中IL-4、IFN-γ及IL-4/IFN-γ恢复健康小鼠的水平[8]，抗病毒复方中药制剂可诱导实验用雏鸡体液免疫应答作用[9]，由茯苓、芍药、薯蓣、地黄、泽泻、山茱萸6味中药组成的复方R6F可提高抗破伤风类毒素免疫力，诱导IgG抗体形成[10]，中草药提取物“益绿素”作为饲料添加剂对鸡免疫器官的发育有明显的促进作用[11]，党参粗提物能够提高青脚麻鸡血清中 ND-HI 和 IBD 的抗体效价[12]，上述研究结果表明，不论是单味中药还是复方中药，在单独使用或者协同疫苗使用时，都可以对动物机体产生一定的免疫促进作用。因此，本试验拟将黄芪、板蓝根、炒白术、茯苓、陈皮、山楂、甘草、山药等中药按一定比例配比煎制成水煮液，经醇沉、浓缩加工后，通过对SD大鼠进行灌胃处理，观察不同时间不同剂量的药剂对不同种类白细胞、血清生化指标的影响，为复方中药免疫促进剂的利用开发提供新的研究基础。

1材料与方法

1.1试验动物

60只24日龄雄性SD大鼠，购自安徽医科大学实验动物中心(许可证号：SCXK皖2011-002)，大鼠等级为SPF级。

1.2仪器设备

BC-2800VET全自动血细胞分析仪(深圳迈瑞公司)；卓越360全自动生化分析仪(上海科华公司)。

1.3中药原料

黄芪、板蓝根、炒白术、茯苓、陈皮、山楂、甘草、山药等中药材，购自安徽省亳州市中药材市场，经安徽科技学院刘文珍老师鉴定符合要求。

1.4试剂及试剂盒

尿酸(UA)测定试剂盒(上海科华)，生产批号：20150324；总蛋白(TP)测定试剂盒(上海科华)，生产批号：20150612； 谷丙转氨酶(ALT)测定试剂盒(上海科华)，生产批号：20150506；谷草转氨酶(AST)测定试剂盒(上海科华)，生产批号：20150601；碱性磷酸酶(ALP)。

1.5自拟免疫促进剂的制备

将黄芪、板蓝根、炒白术、茯苓、陈皮、山楂、甘草、山药等八种中药材分别按不同的比例配比，经水煮、醇沉、浓缩后备用，每毫升药液相当于1g生药。

1.6试验动物分组及样品处理

60只24日龄雄性SD大鼠，随机分为4组，每组15只，分别为对照组、1.5mL/kg组、3.0mL/kg组和6.0mL/kg组，定时称重，定量投料，对照组正常饮水，3个试验组每天定时按大鼠体重的1.5mL/kg、3.0mL/kg和6.0mL/kg折算出需要灌胃的药液量，定时给大鼠灌胃，并于灌胃后10d、30d和60d，分别随机取5只SD大鼠，经乙醚麻醉后心脏采血，一部分血样通过肝素抗凝处理，经全自动血细胞分析仪测定不同种类白细胞数量，另一部分血样血凝后离心，取血清，经全自动生化分析仪测定各生化指标，所有方法均按试剂盒操作说明进行。

1.7试验数据统计分析

试验数据均采用平均数与标准误表示(±SE)，应用SPSS 20.0对试验数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析。设定P<0.05 为显著性水平，P<0.01 为极显著性水平。

2结果与分析

2.1自拟中药免疫促进剂对SD大鼠白细胞的影响

由表1可见，与对照组相比，在SD大鼠灌胃10d时， 6.0mL/kg自拟免疫促进剂可使白细胞总数和中性粒细胞数量极显著减少(P<0.01)，1.5mL/kg自拟免疫促进剂可使淋巴细胞数量显著增加(P<0.05)，3.0mL/kg自拟免疫促进剂可使中性粒细胞数量显著降低(P<0.05)，其余不同剂量组各种白细胞在不同时间与对照组相比无显著性变化(P>0.05)。

表1　不同剂量自拟免疫促进剂对SD大鼠各种白细胞数量的影响

注：*表示同一时间段与对照组相比差异显著(P<0.05)，**表示同一时间段与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

2.2自拟中药免疫促进剂对SD大鼠血清生化指标的影响

由表2可见，与对照组相比，在灌胃后10d，SD大鼠血清中UA含量在3个试验组中都增加，其中3.0mL/kg组显著增加(P<0.05)，当大鼠灌胃到60d时，1.5mL/kg组和3.0mL/kg组大鼠血清中UA的含量与对照组比较都极显著减少(P<0.01)。在灌胃10d、30d、60d后，各试验组TP含量与对照组比较差异不显著(P>0.05)，但在每个相同时间，各试验组与对照组比较其浓度都呈现适度提高。血清中ALT含量在灌胃10d后，1.5mL/kg组出现极显著增加(P<0.01)，灌胃60d时，1.5mL/kg组、3.0mL/kg组和6.0mL/kg组与对照组比较都呈显著或极显著降低(P<0.05 或P<0.01)，但血清中AST含量在10d、30d和60d时，与对照组比较无显著变化。血清中ALP含量在SD大鼠灌胃30d时，3.0mL/kg组和对照组比较出现极显著减少(P<0.01)，但在灌胃60d时，与对照组比较增加但不显著，1.5mL/kg组和6.0mL/kg组与对照组比较呈现极显著减少(P<0.01)。血清中LDH在SD大鼠灌胃10d时，其在1.5mL/kg组、3.0mL/kg组的含量显著增加(P<0.05)，但灌胃30d时，1.5mL/kg组、3.0mL/kg组和6.0mL/kg组与对照组相比LDH含量均极显著减少(P<0.01)，到灌胃60d时，3.0mL/kg组血清中LDH的含量与对照组比较极显著减少(P<0.01)。血清中TC含量在灌胃10d时，1.5mL/kg组与对照组比较含量显著增加，灌胃60d时，6.0mL/kg组TC含量与对照组比较却显著减少。

表2　不同剂量自拟免疫促进剂对SD大鼠部分血清生化指标的影响

注：*表示同一时间段与对照组相比差异显著(P<0.05)；**表示同一时间段与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

3结论与讨论

3.1不同剂量自拟免疫促进剂与SD大鼠白细胞变化的相互关系

药理学研究表明，本自拟中药免疫促进剂组分中，黄芪多糖可以增加淋巴系统和骨髓干细胞的数量并促进其转化为有活性的免疫细胞作用，同时还可以提高正常小鼠巨噬细胞的吞噬功能[13]，板蓝根提取物中存在促进免疫细胞增殖的活性物质，板蓝根多糖能促进机体的免疫活性和免疫器官的发育，提高其体液免疫和细胞免疫等功能[14]。白术能激发免疫反应，水煎剂对小鼠的免疫功能有一定的增强作用[15]，茯苓[16]、陈皮[17]、山楂[18]、甘草[19]、山药[20]等中药材对机体的免疫功能都有一定的促进作用。研究结果表明，在灌胃60d后，各试验组的白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞与对照组比较均出现增加，但增加不显著。推测在灌胃的早期，由于应激和药物的原因，SD大鼠外周血中白细胞会在短期内出现减少，但经过较长时间的灌胃后，试验组的白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞等细胞数量上有适度的增加，但差异不显著，说明复方免疫中药促进剂对其 白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数量的变化影响不显著。

3.2不同剂量自拟免疫促进剂与SD大鼠血清生活指标的相互关系

实验动物血液生化常值是生物医学研究的基础指标，是临床医疗和科学研究的重要依据[21]。血清中TP的浓度反映了机体蛋白质的吸收、合成和分解状况及机体的免疫功能状态[22]，李香子研究结果表明，当血清中TP含量升高时，猪的消化吸收及营养物质代谢加强，特别是蛋白质代谢，提高了仔猪机体的免疫力[23]。本试验结果表明，在灌胃自拟不同剂量免疫促进剂10d、30d和60d后，各试验组SD大鼠血清中TP含量与对照组比较都有适度增加，但增加不显著，其中以1.5mL/kg剂量组增加较多，说明本自拟免疫促进剂可适度提高SD大鼠血清TP浓度，其中以1.5mL/kg剂量适宜。

ALT和AST在评价肝细胞损伤和坏死中具有重要的参考意义，同时在蛋白质分解代谢和非必需氨基酸的合成中起到重要的中介作用[24]，这两种酶主要存在于肝细胞、肌细胞和肾脏组织细胞中，当这些细胞受损时，胞浆中的酶就会释放进入血液，导致血清酶含量的增高[25]。本研究结果表明，ALT在灌胃10d后，1.5mL/kg组血清酶含量显著升高，但到第60d时，各剂量组血清酶含量都极显著或显著低于对照组；AST在灌胃10d后，血清酶含量高于对照组，但至30d和60d时，与对照组比较其含量降低，说明不同剂量的自拟免疫促进剂在灌胃的短期内造成了血清ALT和AST含量升高，但经过适应后，血清中两种酶含量低于或显著及极显著低于对照组，从而表明对SD大鼠肝组织有一定的保护作用。

动物血清中ALP活性相对比较稳定，但当骨代谢出现异常时，ALP活性即发生变化，因此，血清ALP活性被看作是骨代谢重要的生化标志物[26]，ALP由成骨细胞产生，在骨形成中，成骨细胞在数量和功能增加的同时，多表现出血清ALP活性增高。本研究结果表明，灌胃10d后，各剂量组大鼠血清中ALP含量与对照组比较增加，其中以6.0mL/kg组增加极显著，但到30d和60d时，其血清中ALP含量与对照组比较已显著或极显著降低，表明本试验中各剂量组在短期内灌服能增加ALP的活性，但随着灌服时间的延长，其血清中浓度会显著或极显著降低。

UA是微溶于水的晶体结构阴离子有机酸，是嘌呤类物质在人体内经黄嘌呤氧化酶作用代谢的终产物，主要通过肾脏排出。血清中尿酸含量的高低反映了肾脏对尿酸的吸收和肾脏的分泌功能[27]。血清中TC含量增高的直接后果是脂质尤其是胆固醇侵入大血管壁沉积、聚集，促使动脉内膜平滑肌细胞和纤维细胞增生，导致动脉粥样硬化、冠心病、高血压以及脑血管疾病的发生[28]，有研究表明，TC和UA水平有正相关关联性[29]，本研究结果显示，各试验组在灌药10d、30d和60d时，TC和UA的变化规律基本一致，都是在10d时较对照组增加，至30d和60d 时较对照组偏低、显著或极显著偏低。说明对于SD大鼠来说，长期服用本自拟免疫促进剂对于降低血液中TC含量和UC具有一定的促进意义。

LDH是生物体内糖酵解酶之一，广泛存在于肝脏、心脏、肾脏、肺等组织器官中。当上述组织器官出现变性、坏死等病变时，LDH释放到血液中，是组织损伤的较敏感指标之一。本研究结果表明，在灌药10d时，虽然3个试验组与对照组比较呈现增加或显著增加，但随着灌药时间的延长，到30d和60d时，与对照组比较已经减少或极显著减少，特别是1.5mL/kg剂量组，都出现显著或极显著变化，说明该试验组可有效的降低SD大鼠血清中LDH含量，对组织器官有一定的保护作用。

参考文献：

[1]李奇，赵奎君．中药免疫增强剂的研究概况[J]．中国药房，2012，23(39)：3737-3740．

[2]钟石根，冯振卿，李玉华，等．中药用于血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的研究[J]．中国血吸虫病防治杂志，2004，16(1)：23-26．

[3]KUO M C, WENG C Y, HA C L, et al. Ganoderma lucidum mycelia enhance innate immunity by activating NF-kappa B[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2006, 103(2): 217-222.

[4]SUN H X, PAN H J. Immunological adjuvant effect of Glycyrrhiza uralensis saponins on the immune responses to ovalbumin in mice[J]. Vaccine, 2006, 24(11): 1914-1920.

[5]SUN H X. Haemolytic activities and adjuvant effect of Bupleurum chinense saponins on the immune responses to ovalbumin in mice[J]. Vaccine, 2006, 24(9): 1324-1331.

[6]QUAN F S, COMPANS R W, CHO Y K, et al. Ginseng and salviae herbs play a role as immune activators and modulate immune responses during influenza virus infection[J]. Vaccine, 2007, 25(2): 272-282.

[7]杨英．三种中药复方对鸡新城疫疫苗免疫效果的影响[J]．中兽医医药杂志，2015(2)：44-47．

[8]余树民，甘梦，左之才，等．中药复方对免疫抑制模型小鼠细胞因子、免疫球蛋白及红细胞免疫黏附功能的影响[J]．西北农林科技大学学报:自然科学版，2014，42(4)：27-32, 40．

[9]周李，刘群，王赛，等．抗病毒中药复方制剂对雏鸡免疫功能影响的研究[J]．西南民族大学学报:自然科学版，2014，40(2)：179-185．

[10]UNDERWOOD J R, CHIVERS M, DANG T T, et al. Stimulation of tetanus toxoid-specific immune responses by a traditional Chinese herbal medicine[J]. Vaccine, 2009, 27(47): 6634-6641.

[11]金光明，尹芳芳，周甄宝，等．中草药提取物“益绿素”对鸡免疫器官发育的影响[J]．安徽科技学院学报，2010，24(1)：1-3．

[12]杨崤松，董媛艳，宁康健．党参粗提物对免疫青脚麻鸡血清抗体效价的影响[J]．安徽科技学院学报，2012，26(2)：11-14．

[13]仝欣．黄芪主要活性成分的药理作用[J]．时珍国医国药，2011，22(5)：1246-1249．

[14]杨婧妍，何立巍，董伟．板蓝根正丁醇部位对免疫细胞增殖及体外抗氧化活性的研究[J]．南京中医药大学学报，2015，31(2)：160-164．

[15]孙文平，李发胜，陈晨，等．白术多糖对小鼠免疫功能调节的研究[J]．中国微生态学杂志，2011，23(10)：881-882, 886．

[16]张卫元，杨阳，陈翠兰，等．茯苓散对免疫低下小鼠免疫功能的影响[J]．中国兽医学报，2014，34(2)：283-287．

[17]曹贵彬，易凤珍，游金明，等．陈皮苷制剂对爱拔益加肉鸡生长性能、免疫器官指数及小肠黏膜形态结构的影响[J]．动物营养学报，2014，26(3)：710-717．

[18]林科，张太平，朱顺，等．山楂熊果酸的制备及对小鼠免疫功能和肝癌细胞凋亡的影响[J]．中国生化药物杂志，2007，28(5)：308-311．

[19]胡菁，敖明章，崔永明，等．甘草多糖的抗肿瘤活性及对免疫功能的影响[J]．天然产物研究与开发，2008，20(5)：911-913, 938．

[20]许效群，刘志芳，霍乃蕊，等．山药多糖的体外抗氧化活性及对正常小鼠的免疫增强作用[J]．中国粮油学报，2012，27(7)：42-46, 51．

[21]赵安莎，孙于兰，周蓉，等．SD大鼠30天喂养试验血液学指标和血清生化指标参考值探讨[J]．中国比较医学杂志，2003，13(1)：13-15．

[22]高士争，葛长荣，田允波，等．中草药添加剂对生长肥育猪血液生理生化指标的影响[J]．云南农业大学学报，2002，17(2)：164-169．

[23]李香子，张敏，严昌国，等．新型猪用绿色饲料添加剂的开发与应用--对血液生化指标的影响[J]．延边大学农学学报，2003，25(4)：287-291．

[24]宋凯，单安山，李建平．不同配伍酶制剂添加于小麦日粮中对肉仔鸡生长和血液生化指标的影响[J]．动物营养学报，2004，16(4)：25-29．

[25]朱家桥，曹随忠，熊桂林，等．硫辛酸对围产期奶牛血清脂肪代谢和肝功能酶的影响[J]．中国农业科学，2010，43(9)：1933-1938．

[26]何谓霞，张晓雷，刘芃芃，等．实验性佝偻症对鸡血清、肠、肝、肾、骨中碱性磷酸酶活性的影响[J]．畜牧兽医学报，1987(2)：99-103．

[27]郭立新．无症状高尿酸血症合并心血管疾病诊治建议中国专家共识解读[J]．中国实用内科杂志，2011，31(4)：271-273．

[28]周国锋．中药复方对高胆固醇血症大鼠肝脏胆固醇转运机制影响的实验研究[J]．中华中医药学刊，2011，29(11)：2564-2566．

[29]YOU Lili, LIU Aiping, WUYUN Gaowa, et al. Prevalence of hyperuricemia and the relationship between serum uric acid and metabolic syndrome in the Asian Mongolian area[J]. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis, 2014, 21(4): 355-365.

(责任编辑：马世堂)

Effect of Self-designing Traditional Chinese Medicine Immune Promoter on white Blood Cells and Serum Biochemical Indicators of SD Rat

ZHOU Jin-xing1,2, JIN Er-hui1, LI Sheng-he1, JIN Guang-ming3*

(1. College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China;2. Research Center of Cell and Molecular Biology, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China;3. College of Life Science, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Abstract：Objective：To observe the effect of self-designing traditional Chinese medicine (TCM) immune promoter on white blood cells and serum biochemical indicators of SD rat. Methods： After mixing with Radix Astragali, Isantis Indigotica Fort, Atractylodes Macrocephala Koidz, Poria, Citri Reticulatae Pericarpium, Hawthorn, G lycyrrhiza Radix, and Yamaccording to certain proportion, boiled, alcohol sink and enrichment, per milliliter liquids are equivalent to 1g crude drugs. 60 male SD rats of 24 days, are randomly divided into 4 groups, control group, 1.5mL/kg group, 3.0mL/kg group and 6.0mL/kg group respectively, normal drinking water in control group, timing weight of the rest of test groups in every day, after conversion according to 1.5mL/kg, 3.0mL/kg and 6.0mL/kg body weight, and perfuse medicament, collected blood by heart in 10d, 30d and 60d after perfuse medicament, determinating various white blood cell number and serum biochemical indicators by using blood cell analyzer and fully automatic biochemical analyzer. Results：The results showed that the 1.5mL/kg group could increase or increase significantly the number of lymphocytes, 6.0mL/kg group could make total number of white blood cells and neutrophils significantly reduced, the rest of white blood cell number changes was not significant. In 60d after perfuse medicament, levels of serum UA, ALT, ALP and LDH significantly reduced (P<0.01), TC level significantly reduced in 60mL/kg group, the rest of biochemical indicators no significant change in different time. Conclusion： Self-designing traditional Chinese medicine immune promoter could increase partly lymphocyte number of SD rat, reduce levels of serum UA, ALT, ALP and LDH, optimal at 1.5 mL/kg dose group.

Key words:Immune promoter; White blood cells; Serum; Biochemical indicators; SD rat

中图分类号：R965.2

文献标识码：A

文章编号：1673-8772(2016)01-0001-06

作者简介：周金星(1976-)，男，安徽省五河县人，博士，副教授，主要从事组织病理及中草药药理研究。*通讯简介：金光明，教授，E-mail: jgming@126.com。

基金项目：安徽省科技攻关项目(1301042102)；安徽省第七批“115”产业创新团队资助(皖人才[2014]4)；安徽科技学院重点建设学科(AKZDXK2015A04)；安徽科技学院第12批大学生创新课题(15XSZ12)。

收稿日期：2015-11-10