应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

曲　敏，莫春生，刘　佳，刘忠梅，徐义刚，李苏龙

(1. 哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076；2. 辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001；3. 黑龙江出入境检验检疫局，哈尔滨 150001)



应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

曲敏1，莫春生1，刘佳2，刘忠梅3，徐义刚3，李苏龙3

(1. 哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150076；2. 辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001；3. 黑龙江出入境检验检疫局，哈尔滨 150001)

摘要：应用靶序列富集多重PCR (target enriched multiplex PCR，Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的invA基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfbE基因为靶基因，设计3对特异性引物，并与通用引物连接组成Tem-PCR引物，通过反应条件优化，建立了Tem-PCR检测方法.结果表明，建立的Tem-PCR方法特异性强，其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103 CFU/mL、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102 CFU/mL、大肠埃希氏菌O157 2.3×103 CFU/mL.方法不需要优化调整各引物对的浓度，易于使用，有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.

关键词：靶序列富集多重PCR方法；沙门氏菌；单核细胞增生李斯特氏菌；大肠埃希氏菌O157

沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157是引起食物中毒的主要食源性致病菌[1-5].目前，针对食源性致病菌检测的主要方法有传统生化鉴定方法[6-10]、酶联荧光免疫检测方法、胶体金试纸方法、分子探针检测方法、PCR方法、PCR-DHPLC方法[11-15]及基因芯片方法等[16-17].传统生化鉴定方法操作繁琐，检测时间长，完成鉴定工作通常需要5～10 d时间，不能满足食源性致病菌快速检测的要求.免疫学为基础建立的检测方法，虽然检测快速，但灵敏性差，假阳性高.PCR方法因具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，在病原微生物的检测中发挥了巨大的作用，成为主要采用的检测方法.其中，多重PCR检测通量高，可以实现多种致病菌的同时检测，但建立多重PCR方法时需要反复优化各引物对的浓度，以应对不同引物对扩增效率的不均衡性.

靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR, Tem-PCR)技术是一种新颖的引物设计方式与扩增方法，巧妙地克服了多重PCR的扩增不均衡困难.原理是：设计一对没有亲源性通用引物，其浓度较高，足以进行指数扩增.再针对扩增的每一种靶序列，设计一对特异性引物，将它与通用引物连接，成为复合引物，它浓度极低，用于在PCR的最初几个循环中以富集目标序列.这样在保证了特异性的情况下，既提高了灵敏度，又平衡了各种引物的扩增效率[18-19].本研究利用该技术，建立了同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157的Tem-PCR检测方法.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

实验菌株沙门氏菌ATCC 10708、志贺氏菌CMCC 51592、单核细胞增生李斯特菌CMCC 54002、金黄色葡萄球菌CMCC 26003、创伤弧菌ATCC 27562、溶藻弧菌ATCC 17749、霍乱弧菌ATCC 25872、副溶血弧菌ATCC 17802、大肠埃希氏菌O157 ATCC 35150、大肠杆菌ATCC 25922、产肠毒素大肠杆菌ATCC 35401、肠侵袭性大肠杆菌ATCC 43893、肠致病性大肠杆菌ATCC 43887、阪崎肠杆菌ATCC 51329、空肠弯曲菌ATCC 33560、变形杆菌ATCC 49027、蜡样芽孢杆菌ATCC 10987由黑龙江出入境检验检疫局提供.

1.1.2试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP购自日本TaKaRa(大连)公司；所有培养基购自北京兰伯瑞生物技术公司.

1.2方法

1.2.1引物设计

首先人工设计一对与细菌没有同源性的一段碱基序列，作为通用引物(表1引物序列的下划线部分).然后分别以沙门氏菌的invA基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfbE基因为靶基因，选择基因保守区域设计3对特异性引物.特异性引物和通用引物连接构成复合引物.Tem-PCR检测由复合引物和通用引物进行.引物由上海生工公司合成.

表1Tem-PCR 引物序列

细菌基因引物序列(5'→3')产物大小沙门氏菌invAF:AACTGTGTTTACTACTAGGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCR:GGATTTAATGGCTACTCTCAAGATAATAATGATGCCGGC316单核细胞增生李斯特杆菌hlyF:AACTGTGTTTACTACTAGGGTAAGCGGAAAATCTGTCTCR:GGATTTAATGGCTACTCTCATTTCGTTACCTTCAGGATC412出血性大肠杆菌O157rfbEF:AACTGTGTTTACTACTAGGAATTGAAGATTGCGCTGAAGR:GGATTTAATGGCTACTCTCGTGTGGACAGGGTAAAAAAC530

注：划线部分为通用引物，未划线部分为特异性引物.

1.2.2核酸提取

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取实验菌株基因组DNA，具体操作详见说明书.

1.2.3复合引物浓度优化

复合引物终浓度分别为20、40、80、200 nmol/L，其他PCR反应成份为：10 μmol/L的通用引物2 μL、10×PCR Buffer2.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、细菌基因组DNA模板各0.5 μL、5 U/μL的Taq DNA聚合酶0.2 μL、去离子水补充至25 μL，反应体系为25 μL.扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，最终确定复合引物的最佳浓度.

1.2.4Tem-PCR扩增步骤的优化

分别采用二步扩增法和三步扩增法优化Tem-PCR反应条件，经凝胶电泳检测，以确定Tem-PCR最佳反应条件，具体方案见表2.

表2Tem-PCR 扩增方案

扩增方案二步法三步法第一步第二步第一步第二步第三步变性94℃30s94℃30s94℃30s94℃30s94℃20s退火60℃90s46℃30s55℃90s72℃90s46℃20s延伸72℃30s72℃30s72℃60s72℃20s循环数153015635

1.2.5Tem-PCR方法的特异性实验

利用建立的Tem-PCR方法检测1.1.1节所示菌株，以验证本方法的特异性.

1.2.6Tem-PCR方法的简易性评价

利用设计的3对特异性引物(表1中未划线部分)，不经过引物浓度优化，直接进行多重PCR扩增，扩增效果与Tem-PCR方法进行比较.

1.2.7Tem-PCR方法的灵敏度实验

分别将菌体浓度约为1.1×108CFU/mL、5.6×107CFU/mL和2.3×108CFU/mL的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157进行10倍梯度稀释，采用试剂盒法提取每个稀释度细菌基因组DNA，以此作为模板进行Tem-PCR检测，经凝胶电泳检测以确定该方法的灵敏度.

1.2.8Tem-PCR方法的应用性实验

将未检出目标菌的猪肉、牛奶和香肠食品样品分成两组：一组样品经人工随机污染沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157；另一组样品作为阴性对照.分别采用Tem-PCR法和国家标准法(GB 4789.4、30、36)对两组样品进行检测，检测结果进行符合性验证.

2结果与分析

2.1复合引物的浓度优化

结果如图1所示，随着复合引物浓度的增加，目标条带越来越明亮和粗壮.当复合引物浓度为80 nmol/L时，3种致病菌的扩增条带最粗壮和均匀；但当复合引物浓度较大而达到200 nmol/L时，PCR扩增效率出现不均衡.因此，复合引物最佳反应浓度为80 nmol/L.

泳道M—100 bp DNA Ladder Marker；泳道1～4—复合引物浓度分别为20、40、80、200 nmol/L时的扩增产物图1　复合引物浓度优化

2.2Tem-PCR扩增步骤的优化

结果显示：采用三步扩增法能够较均匀地扩增出3条目标带(图2：泳道1)，而二步法扩增出的3条目标带不均衡(图2：泳道2)，单核细胞增生李斯特氏菌条带暗弱.三步扩增法中，第一步保证了特异性引物(复合引物的一部分)与细菌基因组DNA模板结合，达到了富集靶基因的初步目的；第二步保证了复合引物与初步扩增的靶基因模板结合，达到了进一步富集靶基因的目的；第三步保证了通用引物与富集的模板结合，达到高速且均匀的扩增目的.二步扩增法中，复合引物不能很好地发挥富集作用，扩增出现了不均衡现象.所以，三步法更能满足Tem-PCR引物退火温度的要求.

泳道M—100 bp DNA Ladder Marker；泳道1—三步法扩增产物；泳道2—二步法扩增产物；泳道3—阴性对照图2　Tem-PCR扩增步骤的优化

2.3Tem-PCR方法的检测特异性

利用建立的Tem-PCR方法检测1.1.1节所示菌株，结果显示：沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157均为Tem-PCR阳性结果，其他为阴性结果，且未见非特异性扩增条带出现，显示了良好的检测特异性(图3).

2.4Tem-PCR方法的简易性

泳道M—100 bp DNA Ladder Marker；泳道1～17—分别为沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产肠毒素大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、大肠杆菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、变形杆菌、蜡样芽孢杆菌的扩增产物图3　Tem-PCR方法的检测特异性

利用3对特异性引物，未经引物浓度优化，直接进行常规多重PCR扩增，其扩增效果与Tem-PCR方法进行比较.结果如图4所示，Tem-PCR能高效地扩增出三条目标带，而常规多重PCR方法由于未调整引物浓度，导致扩增效率不均衡.沙门氏菌和大肠埃希氏菌O157扩增条带明显，单核细胞增生李斯特氏菌条带微弱.结果证明Tem-PCR方法不用优化引物浓度，方法简单易行.

泳道M—DNA Marker 100 bp Ladder；泳道1—Tem-PCR法；泳道2—传统多重PCR法图4　Tem-PCR方法和常规多重PCR方法扩增效果的对比

2.5Tem-PCR方法的检测灵敏度

将已知菌体浓度的3种致病菌培养液10倍稀释5次后，利用建立的Tem-PCR方法均能同时有效地扩增出靶基因片段(图5)，显示该Tem-PCR方法检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157灵敏度分别为1.1×103、5.6×102、2.3×103CFU/mL.

2.6Tem-PCR检测方法的实用性

采用建立的Tem-PCR方法对沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157随机组合污染的食品样品进行检测，结果显示，利用该方法能够准确检测出污染样品中的致病菌，与传统国家标准方法(简称国标法)(GB 4789.4, 30, 36)检测结果相符合，显示了良好的实用性.见表3.

泳道M—100 bp DNA Ladder Marker；泳道1-7—三种致病菌培养液依次10倍递减稀释液的扩增产物图5　Tem-PCR灵敏度

3讨论

Tem-PCR方法的独特之处在于靶序列的复合引物的浓度极低，用在PCR的最初几个循环中富集目标序列，只有通用引物的浓度足以进行指数扩增.通用引物的浓度通常是复合引物浓度的10倍.整个扩增过程包括富集阶段和扩增阶段.在富集阶段，本实验采用了二个步骤，分别保证了复合引物与相关模板的完全结合，达到了富集目的.在扩增阶段，所有目标基因都采用同一引物(通用引物)进行扩增，所以扩增效率相同，不但所有目标条带都能扩增出来，而且条带亮度相当，解决了传统多重PCR中不同引物扩增效率不均衡问题.因此，Tem-PCR方法不需要优化调整各种引物的浓度，相比传统多重PCR方法，Tem-PCR法变得简单易行.

表3方法验证

样品国标法Tem-PCR法人工污染组猪肉沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌牛奶单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157香肠沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157阴性对照组猪肉--牛奶--香肠--

本研究采用Tem-PCR技术，建立了同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157的方法，避开传统多重PCR方法扩增效率不均衡的缺陷，为简单快速建立致病菌高通量检测方法提供了新的手段.

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Development of target-enriched multiplex PCR assay for simultaneous detection of three foodborne pathogens

QU Min1, MO Chun-sheng1, LIU Jia2, LIU Zhong-mei3, XU Yi-gang3, LI Su-long3

(1. School of Foodstuff Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China; 2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Dalian 116001, China；3. Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China)

Abstract：A novel simple assay of target-enriched multiplex PCR (Tem-PCR) for the simultaneous detection of Salmonella, Listeria monocytogenes , Escherichia coli O157 was developed. Targeted on InvA gene of Salmonella, hly gene of Listeria monocytogenes, rfbE gene of Escherichia coli O157, three pairs of specific primers combined with a universal primer were designed. After optimizing the reaction conditions, the Tem-PCR assay was highly specific, with the sensitivity of 1.1×103 CFU/mL, 5.6×102 CFU/mL and 2.3×103 CFU/mL for Salmonella, Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157, respectively. Tem-PCR is easy to use without optimization of the concentration of each primer, which effectively solves the problem of uneven amplification efficiency in the conventional multiplex PCR.

Key words：Tem-PCR assay; Salmonella; Listeria monocytogenes; Escherichia coli O157

中图分类号：TS207

文献标识码：A

文章编号：1672-0946(2016)01-0033-05

作者简介：曲敏(1966-)，女，博士，教授，研究方向：食品检测.通讯作者：李苏龙(1966-)，男，硕士，研究员，研究方向：微生物检测.

基金项目：质检公益性行业科研专项(201310126)

收稿日期：2015-10-04.