利用宏基因组法筛选新几丁质酶基因

王海东,　胡　忠

1.徐州生物工程职业技术学院, 江苏 徐州 221006;

2.汕头大学生物系, 广东 汕头 515000



利用宏基因组法筛选新几丁质酶基因

王海东1,胡忠2*

1.徐州生物工程职业技术学院, 江苏 徐州 221006;

2.汕头大学生物系, 广东 汕头 515000

摘要：为了寻找新型几丁质酶编码基因，提取了汕头湾海域海底表层沉积物中微生物的宏基因组，采用PCR-DGGE技术扩增和分离获得了新型几丁质酶基因编码信息。实验共得到63条几丁质酶基因片段，其编码的蛋白序列与NCBI数据库收录的序列相似率在41%～97%之间，且大多数在70%以下，只有8条相似率在70%以上，NCBI数据库中与其相似性最高的几丁质酶蛋白序列有18个种属，其中与橙色滑柱菌株 (Herpetosiphon aurantiacus) ATCC 23779的几丁质酶存在着最高相似性的序列有27条，另外，与未可培养细菌几丁质酶基因片段相似的有22条，占34.9%，分属9个种属。说明汕头湾表层沉积物中存在多种几丁质酶编码基因，其中有很多是尚未研究的，为寻找新型的几丁质酶编码基因提供了有力的生物资源。

关键词：汕头湾；几丁质酶；DGGE；宏基因组；表层沉积物

海洋环境中会产生大量的几丁质沉积，所以降解几丁质就成了很多海洋细菌必不可少的特性，几丁质酶基因在海洋细菌中分布十分广泛，几丁质编码基因资源非常丰富，但是99%的微生物都是不可培养的，给获取几丁质基因带来了巨大的困难。采用宏基因组法可以绕过微生物的培养环节直接研究所有微生物的基因信息，通常是构建宏基因组文库，定向筛选获得目的基因，但是受到文库容量、筛选方法和克隆表达等因素的限制，存在一定的盲目性，成功几率较低，本实验直接提取汕头湾表层沉积物中微生物的宏基因组，设计引物直接扩增几丁质酶编码基因片段，以获得几丁质酶的基因信息，以期为寻找新的几丁质编码基因提供一个可行的途径[1,2]。

1材料与方法

1.1材料

汕头内海海域是一个多元、庞大、复杂的系统，根据海域的污染源头、水文地质等情况选取了S1~S9共9个站点采集表层沉积物，以期包括微生物几丁质酶基因最丰富的位置。其中S1为汕头港附近海域；S2为妈屿岛近内海海域；S3为妈屿岛靠外海海域；S4为汕头华能电厂附近海域；S5为海军生活区附近海域；S6为汕头集装箱码头附近海域；S7为牛田洋入海口海域；S8为牛田洋养殖区海域；S9为西溪入海口海域，采集时间为2007年3月，-80℃超低温冰箱保存。

1.2试剂

OMEGA凝胶回收试剂盒 (USA)购自广州威佳生物科技有限公司；2×PCRTaqMix购自广州东盛生物科技有限公司；DNA抽提缓冲液:100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)，100 mmol/L Na2EDTA (pH 8.0)，100 mmol/L Na3PO4缓冲液 (pH 8.0)，1.5 mol/L NaCl，1.0%的CTAB[3]。TER缓冲液: (10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)，RNA酶终浓度20 μg/mL。

1.3方法

1.3.1宏基因组的提取与纯化实验根据已报道的宏基因组提取方法做了一些综合改进，具体为：称取表层沉积物样品5.0 g，加入20 mL DNA抽提缓冲液和溶菌酶20 mg(终浓度1 mg/mL)，37℃，225 r/min消化2 h；加入2 mL 20%(w/V) SDS，65℃水浴15 min，-70℃冰冻15 min，反复冻融3次；加入等体积氯仿:异戊醇(24∶1)，轻轻混匀，9 000 r/min离心15 min，将上层液相移入新的离心管，再抽提一次，上清移入新管；加入等倍体积异丙醇，-20℃放置1 h，4℃ 9 000 r/min离心10 min，弃上清；沉淀用等体积70%乙醇洗2次，溶解于1 mL TER溶液，得宏基因组粗提液，于-20℃保存[4]。粗DNA经1.0%的琼脂糖凝胶电泳，切下目的DNA条带进行回收，按照OMEGA凝胶回收试剂盒操作手册进行。

1.3.2酶基因的扩增实验采用宏基因组为模板，根据18家族几丁质酶催化区域保守氨基酸设计的含有GC夹子的兼并引物对酶基因片段进行扩增[5~9]，引物序列：GCchiR 5′-CGCCCGCCG-CGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCC-CAGGCGCCGTAGARRTCRTARSWCA-3′，chiF 5′-CGTGGACATCGACTGGGARTWYCC-3′。反应条件：95℃ 6 min；94℃ 1 min，50℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 10 min。

1.3.3变性梯度凝胶电泳分析采用美国CBS公司的变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 系统对PCR产物进行分析，以期更直接的获得有差异的几丁质酶基因序列。聚丙烯酰胺凝胶的浓度为12%，变性剂梯度范围为40%～75%，从上至下变性剂的浓度依次递减，PCR产物加入适量上样缓冲液(0.1%溴酚蓝、0.1%二甲苯胺、20%蔗糖)，总量约25 μL，150 V，60℃电泳约9 h，EB Free Reagent 染色，凝胶成像系统拍照分析[10,11]。切下比较清晰的电泳条带，加20 μL TE缓冲液，捣碎溶出DNA，吸取2 μL作为模板，应用上述引物二次扩增后连接pUC-Tm载体[12]，交由上海英骏生物技术有限公司测序，序列信息提交NCBI进行对比分析。

2结果与分析

2.1宏基因组提取

提取的宏基因组要求片段足够长，浓度足够大，以保证最大限度的包含所有微生物的基因信息。实验提取的汕头湾表层沉积物的宏基因组呈微黄色，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 (图1)，其片段在23 kb左右，基本无托尾现象，说明该提取方法比较温和，机械剪切作用温和。提取的9个站点的宏基因组纯化后，采用生物分光光度计检测OD260(λ=260 nm时1 OD=50 μL/mL的dsDNA)、OD280、OD260/OD280的值，结果如表1所示。OD260/OD280在1.7～1.8为最好，太低说明有腐殖质的污染，太高说明有蛋白的污染，本实验样品的 OD260/OD280值均接近这个范围，说明纯化后的宏基因组都比较纯净，进一步计算得到各个站点的宏基因组的浓度都比较高，说明实验提取的宏基因组的完整性、丰度和纯度基本满足进行下一步实验的要求，但各个站点之间也存在着差异。

图1　汕头湾9个站点表层沉积物提取的宏基因组电泳分析Fig.1　Metagenome electrophoresis analysis of surface sediments in Shantou Bay 9 sits.M：λDNA (HindⅢ) marker；1~9分别为S1～S9站点的样品

S1S2S3S4S5S6S7S8S9OD260/OD2801.711.631.661.771.791.681.791.831.86得率(μg/g)19.316.315.621.317.516.923.416.919.6

2.2几丁质酶基因保守区的扩增

提取的9个站点的宏基因组在23 kb左右，符合实验要求，然后以9个站点的宏基因组为模板，扩增其中的几丁质酶基因保守序列(图2)，可以看出各站点的宏基因组均能够很好的扩增出250 bp左右的目的条带。

图2　宏基因组中几丁质酶基因保守区扩增电泳图Fig.2　Amplified chitinase gene conservative region from metagenome.M: Perfect 1kb DNA ladder (SNBC)；1~9分别为S1～S9站点基因扩增样品

2.3DGGE电泳分析

扩增的几丁质酶基因片段进行DGGE电泳，由图3和图4可以看出各个站点之间的几丁质酶多样性差别比较大，其中以站点S6、S7和S8的几丁质酶最为丰富，可能是因为靠近牛田洋养殖区海域的缘故。

2.4几丁质酶基因文库克隆子序列分析

由图3和图4可以看出，第7个站点的条带最为丰富，以其为基础回收差异条带，同时回收其他站点和第7站点相对的差异条带，二次扩增后连接pUC-Tm载体测序，得到63条几丁质酶基因序列，分别命名为CHI1~CHI63，其中有55条不同的序列，提交NCBI得到序列号为：EU700197～EU700251。其编码的蛋白氨基酸序列与NCBI收录的序列相似率分布在41%～97%之间，且大多数在70%以下，只有8个克隆子的相似率在70%以上，NCBI数据库中与其相似性最高的几丁质酶蛋白氨基酸序列有18个种属，其中与橙色滑柱菌株(Herpetosiphonaurantiacus)ATCC 23779的几丁质酶存在着最高相似性的序列有27条，与其他14条相似的几丁质酶基因有类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)(厚壁菌门低G+C革兰氏阳性菌)、嗜麦芽黄单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)、嗜水气单胞菌(γ变形菌门)、鞘酯杆菌(Pedobacter)(拟杆菌门)、线虫(Caenorhabditisbriggsae) (线形动物)、海葵(Nematostellavectensis)(腔肠动物)等的几丁质酶基因序列[13~15]，另外，未可培养细菌的几丁质酶基因片段有22条，占到40%，分属9个种属，具体如表2所示。

表2　几丁质酶蛋白序列与数据库对比信息表

根据所有的蛋白序列信息构建进化关系树，由图5所示，可以观察到所有的序列可以分为3个比较大的组Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，大多数属于第Ⅲ组。

3讨论

利用宏基因组法探索新基因的信息，提取的宏基因组的质量是非常重要的，其直接决定了实验的成败[1,2]，本实验宏基因组的质量能满足后续实验需要。

产几丁质酶的细菌类群主要集中在β-变形菌、γ-变形菌、革兰氏阳性菌和古细菌中，γ-变形菌在海洋中的分布非常广泛，革兰氏阳性菌分布很少[13~15]。根据已知的几丁质酶催化区和结合区的保守氨基酸可以设计兼并引物，实验的引物是根据18家族几丁质酶序列设计兼并引物，结果获得的序列均属于18家族，同时，也说明18家族的几丁质酶基因差异明显，未可培养微生物中的几丁质酶与已知的可培养微生物中的几丁质酶也存在着非常大的差异。

研究过的几丁质酶基因序列信息有限，不足以设计一对或几对引物来很好的扩增所有的几丁质酶编码基因[1,7]，随着对几丁质酶基因研究的深入，获得几丁质酶基因保守序列的信息也越来越多，设计一对或者几对几丁质酶基因的通用引物来扩增大部分的几丁质酶基因序列将会成为可能[2,6,16]。

图5　几丁质酶蛋白保守序列进化关系Fig.5　Phylogenetic tree based on the chtinase gene conservative protein sequences.

实验在沉积物中扩增得到了63条几丁质酶编码基因片段，分属18个种属，与未可培养细菌几丁质酶基因片段相似的有22条，占到34.9%，分属9个种属。说明汕头湾表层沉积物中存在着差异程度非常高的几丁质酶编码基因，并且有很多是未研究的新型基因。同时，说明以宏基因组为载体，用PCR技术分离新的几丁质酶基因是一种可行的方法[16,17]，继续以获得的新几丁质酶基因片段信息设计引物扩增出完整的几丁质酶基因序列将成为可能[18]。

实验证明以宏基因组为载体，绕过微生物的培养环节，直接调取环境中微生物的基因信息是可行的，也必将成为研究的主要方向，本实验也尝试根据新的几丁质酶基因片段信息设计引物，在宏基因组中直接扩增全新的几丁质酶基因并克隆表达，目前尚未获得成功，但这是一个非常值得研究的途径。未来如果结合cDNA文库技术、转录组学和代谢组学等技术可能会使宏基因组文库筛选新型基因的技术更加成熟，实用性更强。

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Screening of New Chitinase Genes with Metagenomics

WANG Hai-dong1, HU Zhong2*

1.XuzhouVocationalCollegeofBioengineering,JiangsuXuzhou221006,China;2.DepartmentofBiology,ShantouUniversity,GuangdongShantou515000,China

Abstract:In order to find new chitinease-encoding genes, we extracted metagenome from surface sediments of the Shantou Bay, and amplified 63 chitinase coding gene fragments using PCR-DGGE. Compared these fragments to NCBI records, the similarity ratios were from 41% to 97%. The most similarity ratios were below 70%, only 8 higher than 70%, and there were 18 species in NCBI chitinase records had the highest similarity ratios. 27 fragments had the highest similarity ratios to the chitinase sequence of Herpetosiphon aurantiacus ATCC 23779. 22 fragments had the highest similarity ratios to uncultured bacteria chitinase sequences which belonged to 9 different species, accounted for 34.9%. The results suggested that there were many different chitinase-coding genes in Shantou Bay sediments, most of them hadn’t yet been studied from now. The paper provided a biological resources for finding new chitinease-encoding genes.

Key words:Shantou Bay; chitinase; DGGE; metagenome; surface sediment

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.07

作者简介：王海东，硕士研究生，研究方向为生物技术。E-mial: wanghaidong6@163.com。*通信作者：胡忠，教授，博士生导师，研究方向为生物技术。 E-mail:hzh@stu.edu.cn

收稿日期：2015-08-14; 接受日期：2015-09-15