AQP1基因沉默对前列腺癌PC-3细胞的影响

牛文斌　孔祥波　马永亮　程　亮　张东升

(佳木斯大学第一附属医院泌尿外科，黑龙江　佳木斯　154002)



AQP1基因沉默对前列腺癌PC-3细胞的影响

牛文斌孔祥波1马永亮程亮张东升

(佳木斯大学第一附属医院泌尿外科，黑龙江佳木斯154002)

〔摘要〕目的探讨水通道蛋白1(AQP1)基因沉默对在前列腺癌PC-3细胞的作用。方法培养PC-3细胞至对数生长期，随机分为质粒转染组和质粒空白组。针对AQP1基因设计合成小片段RNA，并构建高效表达载体。利用转染试剂Lipofectamine(TM)2000用脂质体介导的基因转染技术将质粒转染入PC-3细胞。RT-PCR 检测PC-3细胞AQP1 mRNA的表达情况及激光共聚焦观察室观察、拍照AQP1表达的情况，转染后72 h。将鼠龄为6 w的60只BALB/c(nu-/nu-)雄裸鼠随机分成两组，其中对照组30只，转染组30只。转染组把转染后的前列腺癌PC-3细胞注射裸鼠腋窝处皮下(对照组把未经转染的前列腺癌PC-3细胞注射到裸鼠腋窝处皮下)。每日观察肿瘤生长及体重情况，裸鼠饲养6 w处死，完整取出移植瘤瘤体测量体积和重量。结果与质粒空白组相比，转染组应用RNA干扰技术后AQP-1在前列腺癌PC-3细胞系中mRNA的水平降低，与对照组相比，转染组裸鼠移植瘤体积为(573.39±175.24)mm3 明显小于对照组(1 482.50±327.86)mm3(P=0.03)。转染组肿瘤重量为(0.55±0.11)g明显小于对照组〔(1.31±0.29)g，P= 0.027〕。结论AQP-1广泛的表达在正常前列腺组织和前列腺癌组织中，对内环境稳态起着重要的作用。更多的AQP-1促进了前列腺癌细胞的增长，抑制AQP-1的表达可以使前列腺癌移植瘤生长减慢，体积减小。

〔关键词〕水通道蛋白1(AQP1);前列腺癌

前列腺癌有明显的地区差异和种族差异〔1〕。在我国，近年因为老龄人口增多，同时各种先进仪器设备的大量出现及诊断前列腺癌的方法不断改进，前列腺癌的发病率不断增高〔2〕。水通道蛋白(AQP)-1高度表达于许多肿瘤细胞和肿瘤组织血管内皮细胞，增加肿瘤上皮和血管对水的通透性运输，促进肿瘤的生长及向周围基质浸润〔3〕。以往研究表明AQP1在前列腺癌组织中高表达〔4〕，本实验应用RNA干扰(RNAi)技术和裸鼠前列腺癌移植瘤模型，探讨AQP1的高表达对前列腺癌PC-3细胞和移植瘤组织的影响。

1材料和方法

1.1实验材料人前列腺癌PC-3细胞株(ATCC细胞系)购自中国科学院细胞库，所邮寄的细胞为活细胞。实验所用裸鼠品系为60只6周龄体重均匀的BALB/c(nu-/nu-)裸鼠，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养于佳木斯大学动物实验中心的小鼠饲养隔离器内。

1.2前列腺癌PC-3细胞AQP1免疫组化检测人前列腺癌PC-3细胞按上海中科院细胞库推荐的培养条件，使用含10%胎牛血清的F12培养液，置于37℃，5%二氧化碳(CO2)细胞培养箱中培养，每日在倒置显微镜下观察细胞贴壁情况和细胞生长状态等。待细胞融合度约70%时，吸出培养液。加入0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS)2 ml，作用5 min后吸出弃掉，重复洗片3次。之后加4%多聚甲醛1 ml固定30 min。再次用PBS洗3次，每次5 min。弃掉PBS后加入1%BSA封闭液进行封闭，室温下作用30 min后弃掉BSA封闭液，不用PBS清洗。每块六孔板中的3个孔加入200 μl一抗(兔多克隆抗AQP1一抗，1∶100倍稀释)，另外3个孔对照组加等量抗体稀释液，不加兔多克隆抗AQP1一抗。做好标记，4℃过夜(或37℃孵育2 h)。加一抗后的细胞及对照组细胞4℃过夜(或37℃孵育2 h)后在室温放置2 h，0.01 mol/L PBS洗片3次，每次5 min，避光条件下加入荧光(FITC)标记羊抗兔IgG(荧光二抗,1∶50倍稀释)，室温放置2 h后用0.01 mol/L PBS洗片(避光条件下)3次，每次5 min。做好以上步骤后，将板子里放点PBS，保存片子湿润，不要干片，以免影响细胞形态。到激光共聚焦观察室后，再将爬片取出，在干净的载玻片上滴1滴50%的甘油，然后将爬片取出来倒扣在滴过甘油的载玻片上，显微镜下观察、拍照。

1.3RT-PCR 检测 AQP1 mRNA的表达从前列腺癌PC3细胞系中提取总RNA,紫外分光光度计测定总 RNA纯度并计算其浓度。应用RT试剂盒逆转录合成cDNA 。根据AQP1在GenBank中的cDNA全长序列，使用Primer Premier 5软件设计引物，引物由上海生工生物工程公司合成。进入半定量PCR反应体系,AQP1引物序列：上游:5′-GAAATCCCAACTCCAAAGAG-3′ ;下游:5′-CAGCTAGACAATGATTTGGC-3′,扩增长度为251 bp;人β-actin引物:上游:5′-AGCGCAAGTA CTCCGTGTG-3′ ;下游:5′-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3′,扩增长度501 bp;PCR反应条件:95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,扩增30个循环。上下游引物分别用适量灭菌双蒸水溶解至浓度为10 pmol/μl。 PCR反应体系为cDNA模板1 μl、AQP1上下游引物各0.5 μl、人β-actin上下游引物各0.2 μl。 PCR 产物在 2%琼脂糖凝胶上电泳分析。

1.4siRNA载体构建及转染构建的重组质粒经DNA测序技术证实重组质粒序列与所设计序列完全一致，表明针对AQP1基因的siRNA表达载体构建成功。构建好的CTD468-18超纯质粒用脂质体法成功转染前列腺癌PC-3细胞，转染效率达40%。采用Western印迹法检测各组细胞中AQP1蛋白的表达，结果2组细胞β-actin杂交带亮度相似，在位于28 kD蛋白条带位置均呈现AQP1特异性蛋白杂交条带的表达，但亮度有明显差异，其中转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于空白对照组。

1.5裸鼠的饲养及肿瘤细胞的种植本实验所用裸鼠饲养于佳木斯大学动物实验中心的小鼠饲养隔离器内,观察小鼠的生长状况。取转染72 h的前列腺癌细胞及正常培养的前列腺癌细胞，胰酶消化收获至离心管中，1 000 r/min，5 min，离心后去除培养液，如此反复 PBS 冲洗 3 次，以去除残留的培养液，以苔盼蓝法检测细胞活率，检测存活率90%以上后方可用于接种动物。用 PBS 将细胞调至密度 4×107/ml，重悬细胞并混匀，放入无菌 Eppendorf管，并用封口胶密封，置入冰盒待用。收集好的细胞最好在 30 min 内接种，以保证各组细胞活力。采用6周龄雄性裸鼠60只，随机分为2组，每组30只，分别接种前列腺癌细胞及转染后的前列腺癌细胞，碘伏溶液消毒穿刺点两次。上下颠倒 Eppendorf 管以混匀细胞悬液，用注射器吸取细胞悬液。每只裸鼠皮下注射 200 μl，针头与皮肤大约 10°~15°方向斜行刺入皮肤约1.0 cm，轻轻挑起皮肤后开始注射，以免刺入胸腹腔，注射完毕后，慢慢退出针头，用无菌棉签轻轻按压穿刺点约 2 min，以防细胞悬液溢出。用碘伏溶液消毒穿刺点，以防感染。接种后，每天观察裸鼠，观察裸鼠及肿瘤生长情况，42 d后终止观察处死裸鼠，小心完整剥离出皮下移植瘤。

1.6统计学分析采用SPSS13.0软件行t检验及方差分析。

2结果

2.1AQP1在PC-3细胞的表达通过激光共聚焦显微镜观察、拍照分析及Western印迹蛋白检测，证实AQP1在前列腺癌细胞表达，且主要表达于细胞膜及胞质。激光共聚焦显微镜显示细胞膜及胞质被染成绿色，细胞核未着色(图1A)。转染24 h后荧光显微镜观察： 荧光显微镜下，用紫外光激发，观察细胞。未转染的细胞不显色，转染细胞呈红色荧光(图1B)。

A：AQP1在前列腺癌PC-3 细胞中表达；B：荧光显微镜下siRNA转染的PC-3细胞图1　AQP1在PC-3细胞中的表达(×200)

2.2AQP1 mRNA在PC-3细胞的表达AQP1的RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射仪下在300 bp左右可见明显的特异产物带，表明AQP1正常表达。同对照组相比(0.954±0.032)，转染组表达减弱有统计学差异〔(0.610±0.060)，P<0.05〕。

2.3Western印迹检测转染后PC-3细胞中AQP1蛋白的表达两组细胞β-actin杂交带亮度相似，在位于28 kD蛋白条带位置均呈现AQP1特异性蛋白杂交条带的表达，但亮度有明显差异，其中转染组细胞的蛋白条带亮度明显低于对照组(图2)。

1Marker:2正常前列腺癌PC-3细胞;3转染后前列腺癌PC-3细胞图2　Western印迹AQP1蛋白在正常前列腺癌PC-3细胞及转染后细胞中的表达

2.4裸鼠皮下移植肿瘤体积及重量比较两组裸鼠生命活动正常,无一死亡。与对照组相比，转染组裸鼠移植瘤体积为(373.39±175.24)mm3明显小于对照组(882.50±327.86)mm3(P=0.03)。转染组肿瘤重量为(0.55±0.11)g 明显小于对照组〔(1.31±0.29)g，P=0.027〕。

3讨论

AQPs是家族性膜通道蛋白，能够快速的介导水和一些小分子物质通过。AQPs广泛分布于机体的组织和器官，不同的组织和器官有不同的AQP分布，有时是多种AQP分布于同一器官，有利于维护组织器官的生理功能〔5〕。AQPs除了生理情况下调节微环境维护器官的生理功能外，病理情况下特别是在肿瘤的发生发展机制中起了重要的作用〔6〕， AQPs在前列腺癌中的分布和作用的初步研究表明AQP1在前列腺癌组织中高表达，抑制AQP1的表达可以抑制PC-3细胞的迁移〔7〕。AQP1大量表达于肿瘤细胞膜或许能够改变肿瘤上皮内的渗透压，有助于肿瘤细胞体积及外形的改变，向周围基质浸润〔8〕。前期试验表明〔4，9〕AQP1大量表达于前列腺癌组织中的肿瘤血管内皮细胞和肿瘤细胞的胞质内及胞膜上，其表达量较正常前列腺组织明显增多，但是AQP1在前列腺癌PC-3细胞中的不同水平表达及对前列腺癌PC-3细胞的影响还不清楚。

在本次实验中运用免疫组化和RT-PCR 在不同水平检测了前列腺癌PC-3细胞中AQP1的表达，在激光共聚焦显微镜下观察、拍照，可见前列腺癌细胞薄膜及胞质被染成绿色，胞核未着色，证实AQP1主要表达于前列腺癌细胞膜和胞质。

RNAi是通过双链RNA分子介导的序列特异性转录后使相关基因表达减少或不表达的过程，能够使目标基因稳定沉默但对于正常基因的表达却不造成影响〔10〕。本研究表明RNAi质粒载体的导入明显抑制了前列腺癌PC-3细胞的AQP1蛋白表达。AQP1基因沉默组裸鼠的移植瘤生长速度及体积明显小于对照组，表明干扰AQP1的表达能够抑制肿瘤的发生发展。

综上，AQP1高表达促进了肿瘤的发生发展，阻断或者抑制AQP1的表达能够抑制移植瘤的发展，靶向抑制AQP1可能为前列腺癌的基因治疗提供依据。

4参考文献

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3Beatrice Nico,Tiziana Annese,Roberto Tamma,etal.Aquaporin-4 expression in primary human central nervous system lymphomas correlates with tumour cell proliferation and phenotypic heterogeneity of the vessel wall〔J〕.Eur J Cancer,2011；22(10):1016-26.

4牛文斌，孔祥波，魏巍.前列腺癌中AQP123的表达和作用〔J〕.中国肿瘤临床，2007;31(5)：441-3，446.

5Hwang I,Jung SI,Hwang EC,etal.Expression and localization of aquaporins in benign prostate hyperplasia and prostate cancer〔J〕.Chonnam Med J,2012;48(3):178.

6马永亮，张晓荣.RNA小片段干扰对前列腺癌细胞水通道蛋白-1的影响〔J〕.现代肿瘤医学，2013;21(4)：731-3.

7Pan XY,Guo H,Han J,etal.Ginsenoside Rg3 attenuates cell migration via inhibition of aquaporin 1 expression in PC-3M prostate cancer cells〔J〕.Eur J Pharmacol,2012;683(1-3):27-34.

8谭美芸.水通道AQP1的研究进展〔J〕.中国实用医药，2010;9(5)：241-3.

9牛文斌，王春玲，秦迎春.TSP1与AQP1在前列腺癌中的表达及与血管生成的关系〔J〕.中国老年学杂志，2010;30(24)：3797-8.

10张勇，王振宁.RNA干扰技术及其在肿瘤研究领域的进展〔J〕.中国肿瘤防治杂志，2006;18(13)：1436-9.

〔2014-12-03修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)

〔中图分类号〕R737.25

〔文献标识码〕A

〔文章编号〕1005-9202(2016)07-1596-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.026

基金项目：黑龙江省卫生厅科研课题(2009-328)

1吉林大学中日联谊医院泌尿外科

第一作者：牛文斌(1972-)，男，博士，副主任医师，硕士生导师，主要从事泌尿外科肿瘤研究。