小鼠不同动情周期子宫内膜组织中Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白的表达*

左俐俊，任亚萍

1)桂林医学院研究生学院 桂林 541004　2)桂林医学院组织胚胎学教研室 桂林 541004



小鼠不同动情周期子宫内膜组织中Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白的表达*

左俐俊1)，任亚萍2)#

1)桂林医学院研究生学院 桂林 5410042)桂林医学院组织胚胎学教研室 桂林 541004

关键词Bcl-2;Bax;Caspase-9;动情周期;雌激素；小鼠

摘要目的：探讨Bcl-2、Bax 和Caspase-9在性成熟期小鼠动情周期不同阶段子宫内膜组织中的表达及定位。方法：选取32只性成熟期健康未孕雌性昆明小鼠，通过阴道脱落细胞检测法，根据阴道涂片细胞种类，确定各小鼠所属动情周期阶段，将小鼠分4组(n=8)，分别为动情前期组、动情期组、动情后期组、动情间期组。免疫组化法检测Bcl-2、Bax和Caspase-9蛋白在子宫内膜组织中的表达。结果：Bcl-2在子宫内膜上皮组织中表现出与动情周期相关的规律性表达，动情间期表达高于其他各期(P<0.05)；Bax在各动情周期均有表达，不同动情周期子宫内膜组织中Bax蛋白的表达差异无统计学意义(P=0.796)；Caspase-9在动情期子宫内膜组织中主要表达于黏膜上皮细胞胞质、固有层子宫腺细胞胞质、基质细胞胞质，且动情前期表达低于其他各期(P<0.05)。结论：Bcl-2、Bax、Caspase-9在动情周期中共同调节子宫内膜细胞周期性的增殖与凋亡。

Expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 proteins in mouse endometrium tissue at different stages of estrous cycle

ZUOLijun1),RENYaping2)

1)GraduateSchool,GuilinMedicalUniversity,Guilin5410042)DepartmentofHistologyandEmbryology,GuilinMedicalUniversity,Guilin541004

Key wordsBcl-2;Bax;Caspase-9;estrous cycle;estrogen;mouse

AbstractAim: To explore the expressions of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 in endometrium at different stages of estrous cycle in mature mice.Methods: A total of 32 sexual maturity healthy mice were randomly allocated into 4 groups(n=8),and through the rats vaginal smear observation and types of the cells, the mouse′s estrous cycle stage was clearly determined.Then immunohistochemistry was carried out to screen the protein of Bcl-2,Bax,and Caspase-9 in mice.Results: Bcl-2 was highly appeared in diestrus stage(P<0.05).Bax was also expressed in the estrous cycle but had no significant difference among different stages(P=0.796).Besides, Caspase-9 in each estrus stage of mainly expressed in the mucosa epithelial cytoplasm, lamina propria uterus gland cell cytoplasm,and stromal cell cytoplasm,and it was lowly expressed in the beginning of the estrous cycle(P<0.05).Conclusion: Bcl-2,Bax, and Caspase-9 regulate the proliferation and apoptosis of endometrial cell cycle during estrous cycle.

雌性成年小鼠生殖器官发生增殖、退化的周期性变化称为动情周期，一般为4～5 d,分为动情前期、动情期、动情后期和动情间期。目前较常用的确定小鼠动情周期的方法有外阴直接观察法、阴道栓观察法和阴道涂片法等。阴道涂片法具有直接、便于操作等特点，故该实验采用此法来确定小鼠的不同动情周期。已知育龄期哺乳动物子宫内膜需达到一定厚度，其自然妊娠率最高，适于胚胎植入[1]。那么小鼠在不同动情周期子宫内膜的规律性变化是何因素所为?是否与凋亡因子Bcl-2、Bax和Caspase-9有关?故作者设计该实验来进行探讨，现将结果报道如下。

1材料与方法

1.1仪器及试剂 显微镜(日本奥林巴斯)，微量移液器(德国艾本德)，Bcl-2、Bax、Caspase-9一抗(武汉博士德)，DAB试剂盒(北京中杉金桥)，SABC免疫组化染色试剂盒(福州迈新)。

1.2动物分组及处理32只8周龄SPF级雌性昆明小鼠购自广西医科大学实验动物中心，于桂林医学院实验动物中心饲养，温度25 ℃，湿度55%～65%，光照10～12 h/d，饲料、饮用水均经消毒处理。小鼠均未生育，为确保取材正确，于每日7:00、15:00和22:00阴道涂片观察小鼠，直至每只小鼠完成一个完整的动情周期，连续15 d，结果示该实验小鼠均有完整的动情周期，可以进行下一步操作。

1.3小鼠动情周期的确定及取材用沾有生理盐水的消毒棉签沾取阴道黏液，将棉签黏液涂于载玻片上，经甲醇固定、风干、染色、冲洗、风干等过程，在显微镜下观察阴道脱落上皮细胞形态。根据文献[2]动情周期判定标准进行判断。动情间期：涂片以白细胞为主；动情前期：涂片以有核上皮为主；动情期：涂片以角化上皮为主；动情后期：涂片以角化上皮和白细胞为主。根据涂片判断小鼠动情周期并分为4组(n=8)，将处于不同动情周期的小鼠子宫内膜取材备用，取出的组织置于体积分数10%中性甲醛中固定，用于免疫组化检测。

1.5统计学处理采用SPSS 18.0进行数据分析，不同组间Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2结果

Bcl-2、Bax和Caspase-9在小鼠不同动情周期子宫内膜组织中的表达情况见图1和表1。Bcl-2和Bax在各动情周期小鼠子宫内膜组织中均有表达，棕黄色阳性颗粒主要分布于子宫内膜腔上皮和腺上皮胞质，且小鼠动情间期子宫内膜明显增厚。Caspase-9主要表达于子宫黏膜上皮细胞胞质、子宫腺细胞胞质、基质细胞胞质。

A:动情前期：B:动情期：C:动情后期：D:动情间期。图1　小鼠子宫内膜组织中Bax(1)、Bcl-2(2)、Caspase-9(3)蛋白的表达情况(SABC，×400)

组别nBcl-2BaxCaspase-9动情前期组80.24±0.01*0.28±0.220.20±0.09动情期组80.25±0.020.28±0.410.28±0.05#动情后期组80.22±0.00*0.24±0.090.27±0.03#动情间期组80.27±0.020.27±0.030.26±0.05#F12.7600.34114.020P<0.0010.796<0.001

*:与动情间期组比较，P<0.05；#:与动情前期组比较，P<0.05。

3讨论

子宫内膜对雌激素和孕激素都有反应，雌激素可引起子宫肥大，孕激素可促使子宫内膜发生特殊的妊娠周期变化。正常小鼠血浆雌激素在动情前期开始上升，动情期达到最高，且此期子宫内膜细胞不断分裂增殖，使机体利于受孕[3]。Bcl-2和Bax作为一类重要的凋亡因子，协同调节细胞的增生与凋亡，两者既可形成同源二聚体促进凋亡，也可形成异源二聚体抑制凋亡，且这种二聚体化过程决定了细胞对“死亡”的敏感性[4-6]。其机制是胞质中的Bax插入到线粒体内膜中，导致线粒体膜电位下降，形成Bax通道，促进细胞色素C释放，激活Caspase而诱导细胞凋亡[7-10]。已有研究[11]表明，bcl-2基因在正位和异位子宫内膜均有表达，且雌激素可以促进其表达，孕激素则抑制其表达。该实验结果也证实了这一点，Bcl-2在动情周期各期均有表达，且表达多见于子宫黏膜上皮细胞和固有层子宫腺细胞。此外，该研究结果显示，Bcl-2表达在动情期与动情间期差异无统计学意义，说明动情期子宫内膜的凋亡抑制活动仍在进行中，为子宫内膜增厚、胚胎植入做准备，若未受精，便进入动情后期，凋亡抑制基因表达降低，凋亡加速，子宫内膜变薄。此外，动情间期雌激素将达到一个较高水平，蛋白表达也最高，此期机体凋亡抑制基因也高表达，提示Bcl-2可能通过抑制基底层腺细胞凋亡而发挥作用。也有相关实验[12]显示Bcl-2在人正常子宫内膜腺上皮细胞呈现规律性表达，而该实验发现动情间期Bcl-2表达最高，动情后期为促进细胞凋亡，表达明显降低，说明Bcl-2在子宫内膜呈现出的规律性表达，正是此蛋白对小鼠不同动情周期调节的微观表现。有关文献[13]显示，Bax在育龄期女性整个月经周期中都有表达，这与该实验结果一致。目前对于Bax在子宫内膜的表达情况仍存在争议，曾有学者[14]提出Bcl-2受雌激素调节，并与月经周期有关，且发生着周期性变化，而Bax虽与子宫内膜改变有着必然联系，却不受性激素调节，也无此规律性变化。该研究结果证实Bcl-2和Bax共同调节子宫内膜细胞的凋亡，且Bcl-2表现出与动情周期相关的规律性表达，而Bax虽在各期均有表达，却没有可靠的规律可循，推测Bax可能通过影响Bcl-2的表达起作用，也可能通过其他未知途径来影响内膜腺体的增生与凋亡。

细胞凋亡的机制中主要有2种信号途径，即线粒体途径和死亡受体途径。而在凋亡的线粒体途径中，Caspase-9是Caspase家族中最重要的凋亡起始因子[15-16]。该研究结果显示，Caspase-9蛋白在动情周期各期子宫内膜主要表达在黏膜上皮细胞胞质、子宫腺细胞胞质、基质细胞胞质，说明Caspase-9参与了动情周期更替的全部过程。此外，Caspase-9在动情间期的表达不是最多也不是最少，但同时结合在动情间期子宫内膜最薄的情况下能有较高的吸光度值，充分说明Caspase-9蛋白在单位面积子宫黏膜上皮细胞内表达足够高，这是从动情期开始，子宫内膜便做好了充分的准备，历经后期到间期，Caspase-9在这3期子宫内膜表达最多，为顺利进入下一个动情周期做准备。

综上所述，该研究结果说明Bcl-2、Bax和Caspase-9在不同动情期阶段的子宫内膜组织中有表达，子宫内膜的周期性改变需要三者的协同配合。这也提示，在人类若这个程序被干扰，可能会导致相应的子宫内膜疾病，如功能失调性子宫出血病、子宫内膜异位或癌变等。

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中图分类号R339.2；R-332

#通信作者，女，1973年3月生，硕士，副教授，研究方向：生殖生理与疾病，E-mail：yapingrengl@163.com

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.011

*广西高校科学技术研究项目2013ZD043；桂林市科学研究与技术开发项目20130416-3