HPLC法测定婴幼儿配方乳粉中羧甲基赖氨酸

黄娟，杨俊青，陈松润，仇凯（1.国家青少年食品质量监督检验中心，广东东莞520808；2.中食检测研究院有限公司，广东东莞520808；.中国食品发酵工业研究院，北京100027）



HPLC法测定婴幼儿配方乳粉中羧甲基赖氨酸

黄娟1，2，杨俊青1，2，陈松润1，2，仇凯3
（1.国家青少年食品质量监督检验中心，广东东莞520808；2.中食检测研究院有限公司，广东东莞520808；3.中国食品发酵工业研究院，北京100027）

摘要：乳由于热损伤而发生美拉德反应，产生羧甲基赖氨酸（CML）。研究显示，CML与糖尿病、动脉粥样硬化、人体细胞老化等均呈正相关。本文建立了HPLC方法对婴幼儿乳粉中羧甲基赖氨酸的测定方法。样品经预处理，采用高效液相色谱仪（HPLC）进行测定，色谱柱为C(18)柱，柱温为35℃，流动相为甲醇和醋酸钠缓冲液（pH 6.50，0.048 mol/L）（96∶4，体积比），流速为0.8 mL/min，荧光检测器，激发波长340 nm，发射波长455 nm，外标法定量。结果显示，CML在0.2 μg/mL～35.0μg/mL范围内呈良好线性关系，相关系数（r）为0.9991。最低检出浓度为0.16 μg/mL。选择市售2种品牌奶粉进行加标回收试验，回收率分别为92%和107%。

关键词：HPLC；婴幼儿乳粉；羧甲基赖氨酸（CML）

婴幼儿乳粉的生产工艺过程中需要加热干燥，在这个过程中乳由于热损伤而发生美拉德反应，羧甲基赖氨酸（CML）是美拉德反应进入晚期阶段的一种产物[1]。研究显示，乳加工过程中受热损伤程度与产生的羧甲基赖氨酸含量之间存在正相关性[2]。而且在生物和医学领域，已经有大量的研究表明，CML与糖尿病、动脉粥样硬化、人体细胞老化等均呈正相关。食源性CML作为一种潜在危害物，也引发了人们的关注。目前，国内罕见对于乳粉中羧甲基赖氨酸（CML）定量测定的研究报道，医学临床上常用ELISA方法对样品进行检测，但由于不同样品的制备过程差异较大，定量检验结果稳定性差[3]。本文尝试采用HPLC方法对婴幼儿乳粉中羧甲基赖氨酸进行测定。

1　材料与方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

U-3000高效液相色谱仪（带荧光检测器）、OMS100电热恒温鼓风干燥箱：Thermo；EV311旋蒸仪：Labtech；AL204精密电子天平：Mettler-Toledo；DC-24氮吹仪：上海安谱科学仪器有限公司；带螺盖耐热试管（50 mL）。

1.1.2试剂

甲醇（色谱纯）：Honeywell；0.1 mol/L盐酸溶液、0.1 mol/L氢氧化钠、冰醋酸钠缓冲液（pH = 6.50，0.048 mol/L）：广州试剂厂；0.2 mol/L硼酸钠缓冲溶液：A液[称取1.24 g硼酸（国药集团化学试剂有限公司），蒸馏水定容至100mL]，B液[称取1.91g硼酸钠（NaB4O7· H2O，国药集团化学试剂有限公司），蒸馏水定容至100 mL，用1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH = 9.5]；0.4 mol/L硼酸钠缓冲溶液（pH=9.5）；1mol/L硼酸化钠溶液；OPA试剂：提前24 h配制，贮存在4℃[配制方法：取0.134 3 g o-邻苯二醛（Aladdin）溶于2.5 mL的甲醇中，加入125 μL的β-巯基乙醇（西亚试剂），用0.4 mol/L硼酸钠缓冲溶液（0.4 mol/L，pH=9.5）定容至25 mL]。

1.1.3标准溶液

称取羧甲基赖氨酸标准品（纯度≥98 %）2.5 mg左右（精确至0.1 mg），溶于0.2 mol/L pH 9.5硼酸钠缓冲溶液中，定容至10.00 mL，配制成500 μg/mL标准储备液，放置于4℃可保存3个月。

1.2色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD，5 μm，250 mm×4.6 mm；柱温：35.0℃；波长：荧光检测器，激发波长340 nm，发射波长455 nm；流速：0.8 mL/min；进样量：20 μL；流动相：甲醇（A）：醋酸钠缓冲液（B）（pH 6.50，0.048 mol/L）= 96∶4（体积比），等度洗脱。

1.3样品前处理

1.3.1样品的制备

水解前先进行还原反应：称取0.1 g试样，至于带螺盖的耐热试管中，加入4 mL 0.2 mol/L硼酸钠缓冲溶液和2 mL 1 mol/L硼酸化钠溶液，振荡溶解后，室温下反应4 h。

水解：加入6 mL浓HCl，充N2置换空气后密封，在110℃下水解20 h。

除盐酸：水解后，样品中剩余的盐酸通过旋转蒸发出去（至体积为4 mL～5 mL），样品转移至10 mL容量瓶中，用水定容，进样前使用0.22 μm水相滤膜过滤。

样品衍生：将上述水解液进行衍生，方法是：取100 μL的标品溶液或样品水解液与500 μL OPA试剂，置于1.5 mL小瓶中，涡旋混合。准确反应90 s后进样。

1.3.2标准曲线的配置

吸取标准储备液，并用0.2 mol/L pH 9.5硼酸钠缓冲溶液定容，得到50 μg/mL标准储备液中间液。分别吸取中间液20、200、1.00、2.00、4.00、6.00、7.00 mL，用0.2 mol/L pH 9.5硼酸钠缓冲溶液定容至10.00 mL容量瓶中，得到标准工作液：0.10、1.0、5.0、10.0、20.0、30.0、35.0 μg/mL。以其标准溶液峰的保留时间为依据定性，以其峰面积求出样液中目标物质含量。

羧甲基赖氨酸（CML）的标准品在检测器上的响应谱图见图1。

图1羧甲基赖氨酸（CML）标准品谱图Fig.1 Standard spectrum of CML

婴幼儿配方乳粉中羧甲基赖氨酸（CML）在检测器上的响应谱图见图2。

图2婴幼儿配方乳粉中羧甲基赖氨酸（CML）谱图Fig.2 Standard spectrum of CML in infant formula milk powder

2　结果与分析

2.1线性范围

标准工作液在上述色谱条件下进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，考察目标物的线性范围。

根据羧甲基赖氨酸（CML）的标准曲线浓度和色谱仪的响应值所得标准曲线见图3。

在目标物浓度为0.2 μg/mL～35 μg/mL的范围内，回归线性方程y=251 576.5x+126 259.3，r2=0.999 1。2.2检出限

按1.3中所述对样品（婴幼儿奶粉）进行处理后，取接近噪音（信噪比S/N>3）浓度的样液进按上述色谱进行测定，目标物的最低检出浓度为0.16 μg/mL。

图3羧甲基赖氨酸（CML）标准曲线Fig.3 Standard curve of CML

2.3精密度

在上述色谱条件下，考察样品中婴幼儿奶粉（目标物含量在普通含量水平），重复测定6次，检测结果分别为14.76、16.23、15.38、14.90、15.17、15.28 mg/kg，精密度（相对标准偏差）RSD %为3.4 %。

2.4回收率

称取2种不同品牌的婴幼儿乳粉各0.1 g，均加入500 μL的500 μg/mL羧甲基赖氨酸标准品溶液，在上述色谱条件下测定回收率分别为92 %和107 %。

3　结论

实现了婴幼儿配方乳粉中的羧甲基赖氨酸（CML）的定量测定。通过测定，可考察婴幼儿乳粉生产工艺过程中乳成分的热损伤情况，也是对婴幼儿乳粉质量的严格控制所提出的又一潜在新指标。但是，在检测实验过程中发现羧甲基赖氨酸衍生后易降解，衍生后需立即上机测定，这对于日常检测工作增加了难度。如何实现批量检测，对测定方法和流程进行优化，是今后研究的方向。

参考文献：

[1]韩立鹏,李琳,李冰,等.油脂引发的OH·对食源性羧甲基赖氨酸生成的影响[J].华南理工大学学报(自然科学版),2013(1):139-144

[2]韩荣伟,王加启,郑楠.热处理对牛乳成分的变化影响及热损标识物的选择[J].中国食物与营养,2011,17(7):22-29

[3]魏芹,刘乃丰.羧甲基赖氨酸的研究进展[J].东南大学学报(医学版),2005,24(4):269-273

Determination of Carboxymethyl Lysine in Infant Formula Milk Powder

HUANG Juan1，2，YANG Jun-qing1，2，CHEN Song-run1，2，CHOU Kai3
（1. China National Adolescent Food Quality Supervision and Inspection Center，Dongguan 520808，Guangzhou，China；2. China Foods Detection and Research Institute Co. Ltd.，Dongguan 520808，Guangzhou，China；3. China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：Maillard reaction produced carboxymethyl lysine（CML）when milk had been heat injury. Research showed that positive correlation between CML and diabetes mellitus，atherosclerosis and aging cells of people. This paper established high performance liquid chromatography（HPLC）method for determination of carboxymethyl lysine in infant formula products. After pre-treating the sample was quantified with external standard method used C(18)chromatographic column with the temperature 35℃and methanol-Sodium acetate buffer（pH 6.50，0.048 mol/L）（96∶4，volume ratio）as mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min by FLD detector at 340 nm and 455 nm as excitation and emission wavelength. The result showed that CML had a good linearity in the range of 0.2 μg/mL-35.0 μg/mL，and the correlation coefficient was 0.999 1. The limit concentration of detection was 0.16 μg/mL. The recovery rate were 92 % and 107 % in standard recovery test which choosed two brands of milk powder.

Key words：HPLC；infant formula milk powder；carboxymethyl lysine（CML）

收稿日期：2014-10-13

作者简介：黄娟（1983—），女（汉），工程师，硕士研究生，主要从事食品安全检验工作。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.044