响应面法优化桑叶多糖的超声波辅助萃取工艺

张嫱，熊祥（.北方民族大学生命科学与工程学院，宁夏银川75002；2.合肥工业大学生物与食品学院，安徽合肥230009）



响应面法优化桑叶多糖的超声波辅助萃取工艺

张嫱1，2，熊祥1
（1.北方民族大学生命科学与工程学院，宁夏银川750021；2.合肥工业大学生物与食品学院，安徽合肥230009）

摘要：利用桑树叶片为原料，运用响应面法对桑叶多糖的超声波辅助提取工艺进行优化研究。根据BOX（Box-Benhnken）试验设计原理，确定超声时间、超声温度、萃取液固比对桑叶多糖提取率的影响。结果表明：超声波辅助萃取桑叶多糖的最佳工艺条件为超声温度52℃，超声时间36min，液固比40∶1（mL/g），在此萃取条件下，多糖的萃取率可达3.21%。

关键词：桑叶；多糖；超声辅助提取；响应面分析

桑叶（Mulberry Leaves），又名“铁扇子”，在全世界该属植物大约有16种，中国是世界上桑叶的主要产地之一，主要分布于四川和江浙等蚕养殖量较大的地方。《本草纲目》记载：“桑叶可汁煎代茗，常服可令人肤色光泽，养颜健胃，安魂镇神，称之为神仙叶。[1]”

桑叶的化学成分较复杂，不仅含蛋白质、维生素、脂肪酸、纤维素、碳水化合物等营养成分，而且含有大量的生物活性物质如桑苷、γ-氨基丁酸、生物碱、黄酮及多糖类物质等[2]。研究表明桑叶的不同部位具有明显的生物活性，尤其是桑叶多糖具有显著的降血糖和降血脂作用，被广泛用于药品和功能性食品中[3]。

目前我国对桑叶的利用主要是饲养桑蚕。残渣被大量堆积，不仅造成了极大的资源浪费，还造成环境的污染。鉴于此，本课题以桑叶为原料，运用超声波辅助萃取技术着重研究桑叶多糖的最佳萃取参数，以期为以后桑叶多糖的大规模生产和其产品的深加工提供可行性参考。

1　材料与方法

1.1材料与设备

桑叶：采自北方民族大学校内；葡萄糖、浓硫酸、苯酚均为分析纯。

紫外可见分光光度计、YP2001N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；低温超声波萃取仪：上海比朗仪器制造有限公司。

1.2方法

1.2.1样品预处理

将原料自然干燥后，机械粉碎，然后过筛使其桑叶粉末达到40目。

1.2.2单因素试验

称取一定量的桑叶粉末，装入烧瓶中进行超声波辅助萃取。分别对超声温度、超声时间、液固比进行单因素试验，探讨其对超声辅助萃取效果的影响。

1.2.3响应面设计

在单因素试验的基础上，应用Box-Behnken Design（BBD）中心组合进行三因素三水平的试验设计，选取超声温度、超声时间、液固比为自变量，以桑叶多糖提取率为响应值，采用响应面法进行分析[4]，试验设计见表1。

表1响应面试验因素编码表Table 1 Factors and levers of response surface experiments

1.2.4桑叶多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖的含量[5]，其中标准曲线回归方程为Y=0.046 8X-0.026 9（R2=0.999 0）。

桑叶多糖萃取率/%=萃取液中多糖浓度（mg/mL）×萃取液体积（mL）/萃取原料质量（mg）×100

2　结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1超声时间的影响

准确称取一定量的桑叶，保持超声温度、萃取液固比不变，改变不同的超声时间，其对桑叶多糖萃取率的影响如图1所示。

图1超声时间对桑叶多糖萃取率的影响Fig.1 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

由图1可知，随着超声时间的延长，桑叶多糖的提取率呈现逐渐增加的趋势，超过30 min后，多糖得率逐渐降低，30 min时出现最佳值。其原因可能是随萃取时间的延长桑叶多糖不断的溶出，超声时间越长，多糖得率越高。但扩散达到平衡后，超声时间过长，由于超声波具有较强的机械剪切作用，长时间的超声作用会使大分子的多糖断裂，从而多糖降低[6]。

2.1.2超声温度对桑叶多糖萃取效果的影响

准确称取一定量的桑叶，保持超声时间、萃取液固比不变，改变不同的超声温度，其对桑叶多糖萃取率的影响如图2。

图2超声温度对桑叶多糖萃取率的影响Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide yield

如图2所示，随着超声温度的升高，桑叶多糖得率呈现先增加后减小的趋势，超声温度为50℃时，得率最高。其原因可能是温度的升高，有利于增加溶剂的渗透能力，加快桑叶多糖从细胞向外扩散的速率，使得多糖得率升高。温度过高，会破坏多糖的结构影响其活性[7]。

2.1.3液固比的影响

准确称取一定量的桑叶，保持超声温度、超声时间不变，改变不同的萃取液固比，其对桑叶多糖萃取率的影响如图3。

图3液固比对桑叶多糖得率的影响Fig.3 The effect of solid-liquid ratio

如图3可知，随着液固比的增加，桑叶多糖得率呈现逐渐增加的趋势，液固比为40∶1（mL/g）时多糖得率趋于平缓。这是因为对于一定的原料，随着溶剂的增加，原料与溶剂的接触界面的浓度差增大，从而提高了多糖的扩散速度，多糖得率增大。溶剂量过大，杂质等析出，不利于后续分离，故选择液固比40∶1（mL/g）进行响应面优化。

2.2响应面法提取条件的优化

运用Box-Behnken design法，设计三因素三水平实验，试验设计及结果如表2，对模型进行方差分析，结果见表3。

表2响应面试验设计及结果Table 2 Box-Behnken experimental design matrix and corresponding experimental values

表3响应面方差分析Table 3 Analysis of variance for yield of MLP with extraction conditions

使用Design-Expert 8.0软件对所得数据进行ANOVA分析，以超声温度、超声时间、液固比为响应变量，以桑叶多糖萃取率为响应值，得到表3结果，预测模型如下：

Y＝3.08+0.15A+0.051B+0.066C+0.22AB-0.013AC-0.19BC-0.18A2-0.11B2-0.47C2

比较F值的大小可知各因素对多糖得率的影响顺序是超声温度>液固比>超声时间。该模型整体“Prob>F”值小于0.05，说明具有显著性，表明该模型与实际试验拟合较好，可以用于桑叶多糖的超声萃取实验的预测。且该模型失拟项的Pr >F值大于0.05，不显著，所以该方程对试验拟合是可靠的。

2.3各因素之间的交互作用分析

响应面优化设计图形是特定的响应面Y对应的因素A、B、C构成的一个三维空间在二维平面的等高图，可以直观反映各因素对响应值的影响。响应面的坡度的陡峭程度说明随着影响因素的变化，其对应响应值的变化情况[8]。各因素之间的交互作用对桑叶多糖得率影响的响应面图如图4～图6。

从图4～图6中可知，桑叶多糖萃取率随超声时间的增加先增大后减小，在中心点处出现峰值。液固比的改变也会不同程度的影响多糖萃取率，而超声温度对多糖萃取率的影响相对不明显。超声温度和时间，超声温度和液固比及超声时间与液固比的交互作用较显著；通过响应面优化预测最优萃取条件为超声温度52.14℃，超声时间36.09 min，萃取液固比40.11∶1（mL/g），在此萃取条件下，桑叶多糖的得率最高可达3.12 %。

图4超声温度与超声时间的交互效应曲面图Fig.4 Mutual domino effect bent surface mapping of ultrasonic temperature and time

图5超声温度与液固比交互效应曲面图Fig.5 Mutual domino effect bent surface mapping of ultrasonic temperature and liquid-solid ratio

图6超声时间与液固比交效应曲面图Fig.6 Mutual domino effect bent surface mapping of ultrasonic time and liquid-solid ratio

2.4验证试验

为验证回归模型的有效性，利用响应面得到的最佳工艺条件进行验证试验。由回归方程确定超声萃取桑叶多糖的最佳条件为超声温度52℃，超声时间为36 min，液固比40∶1（mL/g），为了验证该参数，设计了3组平行试验，得到的桑叶多糖萃取率平均值为3.21%，与预测值3.12 %相近。由此证明回归方程拟合良好，试验结果理想。

3　结论

本研究将响应面优化和超声波萃取结合，通过Box-Behnken的中心组合设计，模拟得到提取桑叶多糖的二次多项式数学模型，经验证该模型是合理可靠的，能较好的预测桑叶多糖得率。通过对其关键因素及相互作用进行探讨，确定超声萃取桑叶多糖的因素影响程度：超声温度>萃取液固比>超声时间。经过响应面优化分析得，并采用回归方程修正得到最佳工艺参数为粉碎粒度为超声温度52℃，超声时间36 min，萃取液固比40∶1（mL/g），在此萃取条件下，桑叶多糖的得率为3.21 %。与传统提取方法相比，萃取时间短，操作工艺简单，为进一步开发高附加值的桑叶多糖提供科学依据。

参考文献：

[1]张琳华.桑叶多糖提取分离纯化工艺的研究及其结构性质的初探[D].天津:天津大学, 2005

[2]唐洁.植物多糖生物活性功能的研究进展[J].食品研究与开发, 2006, 27(5): 130-132

[3] Thirugnanasambandham K, Sivakumar V, Maran J P. Microwaveassisted extraction of polysaccharides from mulberry leaves[J]. International journal of biological macromolecules, 2015, 72: 1-5

[4]徐向宏,何明珠．实验设计与Design-Expert、SPSS应用[M]．北京:科学出版社,2010:147-154

[5]赵骏,钟蓉.桑叶多糖提取工艺优选[J].中草药, 2000, 31(5): 347-348

[6]魏海香,梁宝东.超声波法提取珍珠香菇多糖的工艺研究[J].食品研究与开发, 2012, 33(9):49-52

[7]燕航,钟耀广.影响香菇多糖提取的因素研究[J].现代食品科技, 2006, 22(2):179-180

[8]廖素凤,陈建雄,黄志伟,等.响应曲面分析法优化葡萄籽原花青素提取工艺的研究[J].热带作物学报, 2011, 32(3):554-559

Optimization of Ultrasound-assisted Extraction of Polysaccharide from Mulberry Leaves by Response Surface Methodology

ZHANG Qiang1，2，XIONG Xiang1
（1. College of Biological Science and Engineering，Beifang University of Nationalities，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2. College of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，Anhui，China）

Abstract：Technological conditions of extraction of mulberry leaves with ultrasound-assisted extraction were optimized for developing and utilizing the resource of mulberry leaves，by response surface methodology as the method of studying polysaccharide of mulberry leaves. According to the principle of Box -Behnken central composite design，ultrasonic time，extraction temperature and solid -liquid ratio were chosen as response factors，extraction of Polysaccharide from mulberry leaves（MLP）mass as response value，and a three-factor and three levels central composite design was adopted to determine the influence of various technological conditions. The results showed that better extraction conditions were 52℃of temperature，36 min of period，40∶1（mL/g）of liquid - solid ratio. Under these conditions，the yield of MLP was 3.21 %.

Key words：mulberry leaves；polysaccharide；ultrasound-assisted extraction；response surface methodology

收稿日期：2015-05-27

作者简介：张嫱（1980—），女（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物结构与功效研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.030