龙眼壳粗黄酮提取物体内外抗肿瘤研究

宋佳玉，张清伟，刘金宝，郭秋兰（河南漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）



龙眼壳粗黄酮提取物体内外抗肿瘤研究

宋佳玉，张清伟，刘金宝，郭秋兰
（河南漯河医学高等专科学校，河南漯河462002）

摘要：研究龙眼壳粗黄酮提取物体内外抗肿瘤作用。体外试验以MTT法检测龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用。体内试验建立S180荷瘤小鼠模型，观察龙眼壳粗黄酮提取物（100、200、300 mg/kg）组和龙眼壳粗黄酮提取物+CTX（20mg/kg）组的抑瘤率，计算提取物+CTX组小鼠的脾脏指数、胸腺指数、巨噬细胞吞噬指数、吞噬率，并采用ELISA法检测提取物组小鼠血清TNF-α的水平。体外试验显示龙眼壳粗黄酮提取物可显著抑制EC109、HepG2细胞的生长，并呈现一定的浓度依赖性。体内试验显示龙眼壳粗黄酮提取物（低）、（中）、（高）组均可抑制S180肉瘤生长，抑瘤率分别为28.24 %、44.91 %、60.65 %；提取物（低）+CTX组、提取物（中）+CTX组、提取物（高）+CTX组抑瘤率分别为53.7 %、65.74 %、70.37 %，均高于CTX组47.69 %，且与CTX组比较，提取物+CTX组可不同程度地升高荷瘤小鼠的脾脏指数、胸腺指数、巨噬细胞的吞噬率、吞噬指数；和模型组比较，提取物（低）、（中）、（高）组不增加小鼠血清TNF-α水平。龙眼壳粗黄酮提取物可抑制肿瘤细胞生长，具有抗肿瘤作用，且对CTX化疗药物具有增效减毒作用。

关键词：龙眼壳粗黄酮提取物；食管癌细胞EC109；肝癌细胞HepG2；S180荷瘤小鼠；增效减毒

龙眼为无患子科龙眼属常绿果树，乔木。龙眼的果实俗名桂圆，又名木弹、骊珠、益智、亚荔枝、秀木团、龙目、蜜脾、比目、圆眼、川弹子、荔枝奴、燕卵、鲛泪等，为我国著名的亚热带水果。传统中医学认为，龙眼肉能安神、补气血、益心脾，可用于治疗失眠、健忘、惊悸、怔忡、虚劳羸弱[1-2]，龙眼壳无毒、味甘、性温，其散邪祛风、聪耳明目，可治心虚头晕，研细治汤火伤亦佳，已确定龙眼壳中含有核苷类、香豆素、多酚、萜类、糖类等[3-5]，而目前对龙眼壳中黄酮的提取研究报道较少。本研究从龙眼壳中提取了粗黄酮，并对其抗肿瘤作用进行了初步研究。

1　材料与方法

1.1药品与试剂

龙眼：采自福建泉州，取其壳洗净、烘干、粉碎；亚硝酸钠、氢氧化钠、乙醇、硝酸铝：均为分析纯；芦丁标准品：中国药品生物制品检定所；环磷酰胺注射液：江苏恒瑞医药有限公司。

1.2仪器

ALPHA1-2LD plus冷冻干燥仪：德国MARTIN CHRIST公司；RE-3000A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器公司；AL104电子天平：上海速展机电有限公司；101C-2B电热鼓风干燥箱：上海市实验仪器总厂；WFJ-中草药粉碎机：江阴市辉煌机械制造有限公司；HH-1恒温水浴锅：陕西太康生物科技有限公司。

1.3瘤株及动物

食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2、S180肉瘤瘤株：均购于河南省医科所；昆明小鼠（雄鼠），体重（26±3）g：购于河南省医学实验动物中心。

1.4龙眼壳粗黄酮提取物的制备

将龙眼壳洗净、烘干、粉碎，过60目筛，称取约100 g，加8倍量95 %乙醇，浸泡过夜，60℃加热回流提取，每次4 h，重复提取3次，合并3次提取液抽滤，旋转蒸发浓缩，冷冻干燥，即得龙眼壳粗黄酮提取物。1.5龙眼壳粗黄酮提取物定性鉴别

1）盐酸-镁粉反应：在试管中加入1 mL提取物的乙醇溶液，再加镁粉，再加浓盐酸2滴，进行黄酮类化合物的显色反应；2）浓氨水反应：滴1滴提取物的乙醇溶液于滤纸上，之后将其用氨水熏30 s，在紫外灯下立即观察；3）三氯化铝反应：取1滴提取物的乙醇溶液，点在滤纸上，然后再滴加1滴1 %的三氯化铝乙醇溶液，分别在可见光及紫外光下观察颜色变化。

1.6龙眼壳提取物粗黄酮含量的测定

采用聚酰胺吸附-硝酸铝显色法，以芦丁标准品制作标准曲线，得线性回归方程A=1.842 9 C-0.000 4，A为510 nm处吸光度值，C为质量浓度（mg/mL），线性范围为0～0.5 mg，相关系数R2为0.999 9。

1.7 MTT测定龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109、肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用

调整EC109、HepG2细胞浓度为2×103个/mL分别接种于96孔板中，每孔100 μL。试验分为阴性对照组、提取物组、5-Fu组，每组设5个复孔并设空白调零孔。24 h后，阴性对照组加200 μL培养液，提取物组分别加入200 μL终浓度为0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL粗黄酮提取物，5-Fu组加200 μL终浓度为0.38 mg/mL 5-Fu，分别培养48 h后，加入MTT溶液20 μL，培养4 h后加入150 μL二甲基亚砜，用酶联检测仪测定各孔的光密度值（OD）。计算细胞增殖抑制率（IR）。试验重复3次。

1.8龙眼壳粗黄酮提取物对S180肉瘤抑制作用

建立实体瘤模型，将80只昆明小鼠右腋部皮下接种浓度为1×107个/mL的S180细胞悬液，0.2 mL/只。接种后随机分为8组，每组10只。模型组给生理盐水；CTX组仅第1天腹腔注射CTX 20 mg/kg；提取物低、中、高剂量组分别给提取物100、200、300 mg/kg，灌胃，1 d，连续14 d；CTX+提取物低、中、高剂量组第1天腹腔注射CTX 20 mg/kg，然后分别给提取物100、200、300 mg/kg，灌胃，1 d，连续14 d。14天后将小鼠处死，称重，计算抑瘤率。抑瘤率/%＝（模型组瘤重-给药组瘤重）/模型组瘤重×100。

1.9龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响

观察巨噬细胞吞噬功能，按1.8方法观察14天后，将CTX+龙眼壳粗黄酮提取物组、CTX组、模型组小鼠腹腔注射1 mL体积分数为20 %的新鲜鸡红细胞，30 min后将小鼠脱臼处死，将2 mL生理盐水注入其腹腔，并挤压腹部两侧，使腹腔液与生理盐水混合均匀。将1 mL腹腔洗液滴于载玻片上，37℃孵育30 min，然后漂洗、晾干、固定、染色，再漂洗晾干。油镜下数200个巨噬细胞，计算吞噬指数和吞噬率。吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞数/计数的巨噬细胞数（200个），吞噬百分率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞（200个）。称取脾脏、胸腺重量，按照下列公式分别计算脾脏指数、胸腺指数：脾脏指数=脾脏重/体重，胸腺指数=胸腺重/体重。

1.10 ELISA法检测荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白的表达

按1.8方法观察14天后，眼眶采血，收集提取物组、CTX组、模型组小鼠血液0.5 mL～1.0 mL，3 000 r/min，4℃，离心10 min，然后取上清。按照小鼠TNF-αELISA试剂盒使用说明书进行操作，测定荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白含量。

1.11统计学处理

SPSS 13.0统计分析软件分析，计量资料结果以x±s表示，行t检验及方差分析，P<0.05表示有统计学意义。

2　结果

2.1龙眼壳粗黄酮提取物定性检验结果

1）盐酸-镁粉反应：在泡沫处呈紫红色；2）浓氨水反应：在紫外灯下观察，滤纸上呈现出极明显的灰褐色斑点；3）三氧化铝反应：在可见光下滤纸上呈现出灰黄色斑点，在紫外光下滤纸上呈现出黄褐色荧光斑点，以上3个检验结果均表明提取物中含有黄酮类化合物。

2.2龙眼壳提取物中粗黄酮含量

经聚酰胺吸附-硝酸铝显色法检测龙眼壳提取物中粗黄酮含量约为61.98 %。

2.3龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109和肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用（48 h）

龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109和肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用（48 h），结果见表1。

表1龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109和肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用（±s，n=5）Table 1 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2（x±s，n=5）

表1龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109和肝癌细胞HepG2的增殖抑制作用（±s，n=5）Table 1 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2（x±s，n=5）

注：*：与阴性对照组比较，P<0.05；-：不加任何药物。

EC109　HepG2 OD　 IR/%　 OD　 IR/%阴性对照　-　 0.30±0.023　 -　0.30　-5-Fu　 0.38　 0.16±0.009*46.67　 0.14±0.014*53.33提取物　0.10　 0.25±0.017　 16.67　 0.26±0.021　 13.33 0.30　 0.18±0.021*　38.45　 0.20±0.032*　33.33 0.60　 0.16±0.015*40.00　 0.19±0.014*36.67 0.90　 0.14±0.025*　53.33　 0.15±0.017*　50.00 1.20　 0.12±0.030*　60.00　 0.14±0.026*　53.33分组　　浓度/ （mg/mL）

由表1可见，药物作用48 h后，龙眼壳粗黄酮提取物对食管癌细胞EC109和肝癌细胞HepG2有增殖抑制作用，且呈一定的浓度依赖性。

2.4龙眼壳粗黄酮提取物对S180肉瘤的生长抑制作用及对CTX的增效作用

眼壳粗黄酮提取物对S180肉瘤的生长抑制作用及对CTX的增效作用见表2。

表2龙眼壳粗黄酮提取物对S180肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）Table 2 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on S180 Sarcoma（±s，n=10）

表2龙眼壳粗黄酮提取物对S180肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）Table 2 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on S180 Sarcoma（±s，n=10）

注：*：与模型组比较，P<0.05；#：与CTX组比较，P<0.05；-：用生理盐水灌胃，不用药物。

体重/g　　瘤重/g　抑瘤率/%模型组　-　 26.11±2.79 29.05±3.34　 2.16±0.90　 -CTX组　20　 26.74±2.43 27.84±2.98　 1.13±0.73　 47.69提取物（低）　100　 26.52±1.85 29.36±2.11　 1.55±0.86*　28.24提取物（中）　200　 27.01±2.44 29.76±1.94　 1.19±0.77*　44.91提取物（高）　300　 26.21±2.78 29.97±3.01　 0.85±0.45*　60.65提取物（低）+CTX 100+20　 27.48±2.59 29.17±2.35　 1.00±0.52　 53.70提取物（中）+CTX 200+20　 27.93±2.48 28.64±3.07 0.74±0.34#65.74提取物（高）+CTX 300+20　 28.58±2.69 28.94±2.87 0.64±0.36#70.37组别　　剂量/ （mg/kg）试验前体重/g试验后

由表2可见，提取物低、中、高剂量组抑瘤率分别为28.24 %、44.91 %、60.65 %，可见龙眼壳粗黄酮提取物可显著抑制S180肉瘤生长并呈现一定量效关系；提取物（低）+CTX组、提取物（中）+CTX组、提取物（高）+ CTX组抑瘤率分别为53.7 %、65.74 %、70.37 %，高于CTX组47.69 %，可见龙眼壳粗黄酮提取物能增强CTX作用效果。

2.5龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响

龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠免疫功能的影响见表3。

由表3可见，与模型组相比，CTX组脾脏指数、胸腺指数、巨噬细胞的吞噬指数、吞噬率均降低；与CTX组相比，提取物+CTX组以上各指标均增高，且差异显著（P<0.05）。

表3龙眼壳粗黄酮提取物对荷瘤小鼠免疫功能的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of coarse flavones extract from longan shell on the immune function of tumor bearing mice（±s，n=10）

表3龙眼壳粗黄酮提取物对荷瘤小鼠免疫功能的影响（±s，n=10）Table 3 Effects of coarse flavones extract from longan shell on the immune function of tumor bearing mice（±s，n=10）

注：#：与CTX组比较，P<0.05；-：用生理盐水灌胃，不用药物。

组别　　量/（g/kg）胸腺指数/ 10－3脾脏指数/ 10－3吞噬百分率　　吞噬指数模型组　-　 2.04±0.32 6.56±0.87 0.31±0.08 0.54±0.12 CTX组　20　 1.65±0.18 5.17±0.74 0.15±0.06 0.18±0.07提取物（低）+CTX　 100+20　 2.48±0.65#7.68±0.89#0.29±0.07 0.65±0.17#提取物（中）+CTX　 200+20　 2.39±0.52#7.98±1.46#0.38±0.05#0.70±0.15#提取物（高）+CTX　 300+20　 2.77±0.64#8.15±1.94#0.36±0.09#0.68±0.18#

2.6龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影响

龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影响见表4。

表4龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影响（±s，n=10）Table 4 Effects of coarse flavones extract from longan shell on TNF in serum of tumor bearing mice（±s，n=10）

表4龙眼壳粗黄酮提取物对S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影响（±s，n=10）Table 4 Effects of coarse flavones extract from longan shell on TNF in serum of tumor bearing mice（±s，n=10）

注：-：用生理盐水灌胃，不用药物。

组别　　剂量/（g/kg）　TNF－α含量/（pg/mL）模型组　-　23.39±4.83 CTX组　20　22.87±3.22提取物（低）　100　24.34±3.98提取物（中）　200　23.67±4.45提取物（高）　300　25.11±4.89

由表4可见，提取物（低）组、提取物（中）组、提取物（高）组小鼠血清TNF-α水平和模型组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3　讨论

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物。它广泛存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实等中，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样。黄酮类化合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞具有许多重要的生理、生化作用，如具有抗心脑血管疾病、抗辐射、抗炎镇痛、免疫调节、降血糖、抗氧化、抗衰老、抑菌抗病毒、抗肿瘤、治疗骨质疏松等作用[6-10]。

龙眼，俗称桂圆，为著名的水果和重要的药材，刘焕云[11]等采用微波辅助提取法，从龙眼壳中提取了黄酮，并证明其在体外具有一定的抗氧化作用，周琼花[12]等从龙眼叶中提取了黄酮，并证明了其在体外也具有一定的抗氧化作用，本试验从龙眼壳中提取了粗黄酮，并初步研究了其体内外抗肿瘤作用，体外研究结果显示，龙眼壳粗黄酮提取物可显著抑制食管癌细胞EC109和肝癌细胞HepG2的生长，且呈现一定的浓度依赖性；体内试验结果显示龙眼壳粗黄酮提取物低、中、高剂量组可明显抑制S180肿瘤细胞的生长，抑瘤率分别为28.24 %、44.91 %、60.65 %，提取物（低）+ CTX组、提取物（中）+CTX组、提取物（高）+CTX组抑瘤率均高于CTX组（47.69 %），其中提取物高剂量+ CTX组比CTX组的抑瘤率提高了22.68个百分点，且与CTX组比较，提取物+CTX组可不同程度地升高荷瘤小鼠的胸腺指数、脾脏指数、巨噬细胞的吞噬指数、吞噬率，可见龙眼壳粗黄酮提取物可显著抑制肿瘤细胞的增长，提高化疗药物CTX疗效，并且能增强小鼠机体免疫力，能够对抗化疗药物CTX所致的免疫器官萎缩，免疫力的下降等不良反应即降低CTX毒性。为了进一步的了解龙眼壳粗黄酮提取物的抗肿瘤作用机制，本试验采用ELISA法检测提取物组小鼠血清TNF-α的水平，试验结果显示模型组和提取物组TNF-α的水平差异并无统计学意义，说明龙眼壳粗黄酮提取物是通过其他机制来发挥抗肿瘤作用的，其具体抗肿瘤机制还有待于进一步深入研究。

参考文献：

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[11]刘焕云,王海燕,梁燕.龙眼壳黄酮的微波提取及体外抗氧化活性研究[J].天然产物研究与开发,2015,27(3):434-441

[12]周琼花,黎入荧,青增济,等.龙眼叶黄酮的体外抗氧化活性[J].食品研究与开发,2013,34(9):16-18

The Antitumor Effects of Coarse Flavones Extract from Longan Shell in Vitro and Vivo

SONG Jia-yu，ZHANG Qing-wei，LIU Jin-bao，GUO Qiu-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Abstract：To investigate the antitumor effects of coarse flavones extract from longan shell in vitro and vivo. In vitro，MTT method was used to detect the inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2. In vivo，S180-bearing mice were given coarse flavones extract from longan shell and the tumor inhibitory rates of mice were detected in coarse flavones extract（100，200，300 mg/kg）groups and coarse flavones extract combined with CTX（20 mg/kg）groups. The thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were calculated in coarse flavones extract combined with CTX proups. ELISA method was used to detect the the levels of serum TNF-α in coarse flavones extract groups. In vitro，the results showed that the coarse flavones extract of longan shell significantly inhibited the growth of EC109 andbook=41,ebook=48HepG2 cells，and showed a certain concentration dependence.In vivo，the results showed that the coarse flavones extract of longan shell（low），（middle）and（high）group could inhibit the growth of S180 sarcoma，and the inhibition rate was 28.24 %，44.91 % and 60.65 % respectively. The tumor inhibitory rates of coarse flavones extract combined with CTX were 53.7 %，65.74 %，70.37 %，which were higher than that of CTX administration alone（47.69 %）. Compared with those in CTX group，the thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly elevated in all coarse flavones extract combined with CTX groups. Compared with the model group，the extract（low），（middle）and（high）groups did not increase the level of serum TNF-αin mice. The coarse flavones extract from exocarp of longan had antitumor effect and could inhibit the growth of S180 tumor and and had synergistic attenuation effect of CTX.

Key words：coarse flavones extract from exocarp of longan；EC109；HepG2；S180-bearing mice；synergistic attenuation effect

收稿日期：2015-05-21

作者简介：宋佳玉（1981—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：肿瘤药理。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.010