溶菌酶分子印迹材料的制备及吸附性能研究

李培绪（潍坊科技学院综合教育学院，山东寿光262700）



溶菌酶分子印迹材料的制备及吸附性能研究

李培绪
（潍坊科技学院综合教育学院，山东寿光262700）

摘要：采用γ-氨丙基三甲氧基硅烷（AMPS）对硅胶进行改性，然后将聚甲基丙烯酸聚合接枝到AMPS-SiO2表面上，再以乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂进行交联聚合，溶菌酶（LYZ）为模板分子，得到表面具有溶菌酶分子印迹聚合物的硅胶材料（LYZ-MIP-PMAA/SiO2）。采用红外、扫描电镜和粒径测定等方法对LYZ-MIP-PMAA/SiO2进行了表征。通过静态和动态吸附试验研究LYZ-MIP-PMAA/SiO2对溶菌酶的吸附性能，并以牛血清蛋白等为竞争底物，研究其选择吸附性能。结果显示，LYZ-MIP-PMAA/SiO2对溶菌酶的吸附能力明显大于空白分子印迹硅胶（NIP-PMAA/SiO2），其对溶菌酶和牛血清蛋白的分离因子为1.20，说明其对溶菌酶具有较好的选择吸附性能。

关键词：硅胶；溶菌酶；表面分子印迹；吸附性能

溶菌酶（Lysozyme），化学名称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，是一种碱性酶，广泛存在于哺乳动物的体液、禽类的蛋白以及某些植物中。溶菌酶能够使很多细菌的细胞膜中糖蛋白类多糖发生水解，从而使细胞膜溶解而溶解细菌，起到杀死细菌的作用，因此溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。由于溶菌酶具有较好的抑菌作用，且无毒、安全，因此在食品行业受到重视，例如可用于食品的储存[1-2]。溶菌酶在实际样品中的含量很低，直接分析测量比较困难，一般都需要对样品进行预处理，而传统的分离富集方法没有特异选择性，富集倍数不高[3-5]。

分子印迹聚合物（MIP）是一种对模板分子具有特异识别选择性的高分子材料，已经在色谱分离、固相萃取、手性分离、传感器以及膜分离等领域得到应用[6-9]。将MIP应用于溶菌酶的分离富集，有助于克服目前传统材料对LYZ没有选择性、富集倍数不高的缺陷。

2000年以来有关LYZ-MIP的研究报道不多[10-12]。本文以硅胶为载体，溶菌酶作为分子模板，甲基丙烯酸（MAA）作为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）作为交联剂，通过接枝聚合，制备了硅胶表面分子印迹聚合物，考察了其对溶菌酶的选择性吸附性能，为其作为分离富集材料应用于溶菌酶的检测提供试验参考。

1　材料与方法

1.1材料

溶菌酶（≥95 %，≥20 kU/mg）：上海伊卡生物技术有限公司；牛血清白蛋白（≥98 %）：北京博尔西科技有限公司；硅胶（200目～300目）：青岛世纪海洋干燥剂有限公司；γ-氨丙基三甲氧基硅烷（AMPS）：南京创世化工助剂有限公司；甲基丙烯酸（MAA）：上海和发实业有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）：天津科密欧化学试剂开发中心；过硫酸铵、醋酸、甲醇等均为分析纯试剂。

1.2仪器

IR Prestige-21傅里叶红外光谱仪：日本岛津公司；Mastersizer2000激光粒度分析仪：英国马尔文公司；Quanta200E环境扫描电子显微镜：荷兰FEI公司；T6-1650E紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1硅胶的活化

将硅胶加入体积分数为50 %的硝酸溶液中，室温下充分搅拌后静置24 h，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，真空干燥得活化硅胶SiO2。

1.3.2硅胶的表面改性

将0.3 g SiO2-NPs和5 mL γ-氨丙基三甲氧基硅烷（APTES）加入50 mL无水甲苯中，在氮气保护下加热回流反应24 h，无水甲苯洗涤，真空干燥得氨基修饰的SiO2。

1.3.3甲基丙烯酸在硅胶表面的接枝聚合

将1.5 g AMPS-SiO2和5 mL单体甲基丙烯酸（MAA）加入100 mL水中，通氮气30 min。然后加入0.055 g过硫酸铵，在40℃、N2保护下反应10 h。聚合结束后，抽滤，用索式提取器以乙醇抽提得到的聚甲基丙烯酸（PMAA）接枝硅胶（PMAA/SiO2）24 h，真空干燥。

1.3.4溶菌酶表面分子印迹硅胶材料（LYZ-MIPPMAA/SiO2）的制备

称取1.0 g PMAA/SiO2加入100 mL、1.0 g/L的LYZ-甲醇溶液中，常温震荡4 h，然后过滤，真空干燥。将1.0 g饱和吸附溶菌酶的接枝硅胶，加入50 mL LYZ-乙醇/水混合溶液（1∶1，体积比ROX浓度为1.0 g/L）中，将pH调节为9，然后于45℃下加入0.2 mL EDMA搅拌反应8 h。抽滤，用甲醇/冰醋酸溶液（9∶1，体积比）、蒸馏水反复洗涤固体微粒，直至中性为止，以除去溶菌酶，真空干燥。

在不加模板分子的情况下，采用与LYZ-MIPPMAA/SiO2相同的步骤制备空白表面分子印迹（NIP）硅胶（NIP-PMAA/SiO2）。

1.3.5表征

采用溴化钾压片法，用日本岛津公司的IR Prestige-21傅里叶红外光谱仪对AMPS-SiO2和PMAA/ SiO2进行红外色谱分析。将硅胶、AMPS-SiO2和LYZ -MIP-PMAA/SiO2进行表面喷金后，用荷兰FEI公司的Quanta200E环境扫描电子显微镜观察形貌。用英国马尔文公司的Mastersizer2000激光粒度分析仪进行粒径和分布测定。

1.3.6建立标准曲线

溶菌酶在290 nm波长处有最大紫外吸收，利用这一特性可以使用紫外分光光度法对溶菌酶进行测定。准确称取125 mg溶菌酶，然后溶解于浓度为0.85 %的氯化钠溶液中，配制为500 μg/mL的溶菌酶标准溶液。准确量取溶菌酶标准溶液1、2、3、4、5 mL，分别加入10 mL容量瓶中，然后用浓度为0.85 %的氯化钠溶液稀释至刻度。在290 nm波长下，分别测定上述溶液的紫外吸光度，以浓度对吸光度制作标准曲线并进行线性回归。

1.3.7 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的静态吸附性能研究

准确量取LYZ-MIP-PMAA/SiO2各16份，分别放置在5 mL的离心管中，编号1号～16号，在1号中加入3mL甲醇作为对照组，另外2号～16号，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 g/L的溶菌酶溶液各3 mL。将1号～16号样品放入振荡器中震荡24 h，离心后取上清液测定溶菌酶的浓度。

1.3.8 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的动态吸附性能研究

准确称取10 mg LYZ-MIP-PMAA/SiO2各9份，分别加入5 mL小试管中，然后在每一个小试管内加入相同浓度的溶菌酶溶液3 mL，在振荡器中充分混合均匀。分别于10、30、60、90、120、150、180、240、300 min收取上清液，测定溶菌酶的浓度。

1.3.9选择性吸附试验

为了表征LYZ-MIP-PMAA/SiO2的选择吸附性能，选择与溶菌酶结构类似的牛血清白蛋白作为竞争底物进行选择性吸附试验。分别量取1 mmol/L的溶菌酶和牛血清白蛋白各3 mL，分别加入10 mg LYZMIP-PMAA/SiO2和NIP-PMAA/SiO2，振荡器震荡24 h，收取上清液，测定溶菌酶和牛血清白蛋白的浓度。通过静态分配系数KD以及分离因子α来表示其选择性吸附性能。静态分配系数KD和分离因子α的表示式分别为：

式中：CP是溶质被吸附的浓度，μmol/g；CS是溶质在溶液中的浓度，μmol/mL；KD′是模板分子的静态分配系数；KD″是竞争底物的静态分配系数。一般情况下，分离因子α越大，表示对模板分子的选择性越高。

2　结果与分析

2.1红外光谱分析

SiO2、AMPS-SiO2和PMAA/SiO2的红外光谱图见图1。

图1 SiO2（A）、AMPS-SiO2（B）和PMAA/SiO2（C）的红外光谱图Fig.1 FTIR spectra of SiO2（A），AMPS-SiO2（B）and PMAA/SiO2（C）

在图1的SiO2红外光谱图中，1 100 cm-1是Si-OSi和Si-O-H的伸缩振动峰，966 cm-1和803 cm-1是Si-O-H的伸缩振动峰，3 445 cm-1和1 637cm-1是-OH的伸缩振动峰。在AMPS-SiO2的红外光谱图中，3445cm-1的-OH伸缩振动峰明显变小，966 cm-1的Si-O-H的伸缩振动峰基本消失，新出现了3 750 cm-1、1 583 cm-1和1 482 cm-1的-NH伸缩振动峰，以及2 940 cm-1的-CH伸缩振动峰，说明硅胶表面大部分羟基已经反应，AMPS已经接枝到SiO2表面。在PMAA/SiO2的红外光谱图中，新出现了700 cm-1的游离-COOH的特征吸收峰，且3 445 cm-1的-OH特征峰明显增强，说明MAA已成功接枝到改性SiO2上。

2.2扫描电镜和粒径分析

硅胶、AMPS-SiO2和LYZ-MIP-PMAA/SiO2的扫描电镜照片见图2。

图2硅胶（A）、AMPS-SiO2（B）和LYZ-MIP-PMAA/SiO2（C）的SEM照片Fig.2 SEM images of SiO2（A），AMPS-SiO2（B）and LYZ-MIPPMAA/SiO2（C）

由图2可知，活化硅胶颗粒表面比较光滑、干净，而接枝AMPS和MIP后，硅胶表面明显有附作物，表面变得粗糙，这是因为AMPS和MIP聚合物接枝在硅胶表面造成的。经用粒度测定仪测定，未经修饰的硅胶颗粒平均粒径（d50）为56.4 μm，ROX-MIP-PMAA/ SiO2的平均粒径（d50）为62.8 μm。在表面接枝和聚合之后，硅胶颗粒表面形成了聚合物的薄膜层，而且表面聚合物层也会造成颗粒黏连，从而使得粒径增大。2.3标准曲线

溶菌酶标准曲线见图3。

图3溶菌酶标准曲线Fig.3 The standard curve of lysozyme

按照1.2.6的方法，以吸光度（A）对浓度（C）进行线性回归，得回归方程为y = 0.021 0 x - 0.035 98（y= A，x =C），R2= 0.999 6（n=5）。

2.4 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的静态吸附性能

LYZ-MIP-PMAA/SiO2和NIP-PMAA/SiO2的吸附等温线见图4。

图4 LYZ-MIP-PMAA/SiO2（A）和NIP-PMAA/SiO2（B）的吸附等温线Fig.4 The adsorption isotherm curve of LYZ-MIP-PMAA/SiO2（A）andNIP-PMAA/SiO2（B）

从图4中的吸附等温曲线可以看出，随着溶菌酶溶液浓度的增加，LYZ -MIP -PMAA/SiO2和NIP -PMAA/SiO2对溶菌酶的吸附量呈现快速增大趋势，随后逐渐达到平衡。由图4可知，LYZ-MIP-PMAA/SiO2和NIP-PMAA/SiO2对溶菌酶的吸附平衡浓度分别为2.6g/L和2.0g/L，饱和吸附量分别为93 mg/g和61 mg/g，LYZ-MIP-PMAA/SiO2的饱和吸附量明显大于NIPPMAA/SiO2。在LYZ-MIPPMAA/SiO2和NIP-PMAA/ SiO2的制备中都加入功能单体甲基丙烯酸以及交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯等物质，均含有羟基、羧基等功能基团，对模板分子具有一定的物理作用，可形成非印迹的结合作用位点，因此NIP-PMAA/SiO2对溶菌酶也具有一定的非印迹物理吸附作用，但是这种吸附作用是非特异性的。对于LYZ-MIPPMAA/SiO2，除了存在非特异性的物理吸附，还存在因模板分子洗脱后留下的印迹空穴产生的特异性吸附，因此其对溶菌酶的吸附量明显增大，明显大于NIP-PMAA/SiO2。

2.5 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的动态吸附性能

LYZ-MIP-PMAA/SiO2的动态吸附曲线见图5。

图5 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的动态吸附曲线Fig.5 The absorption kinetic curve of LYZ-MIP-PMAA/SiO2

从图5知，在前60 min，LYZ-MIP-PMAA/SiO2的吸附量增加较快，60 min后吸附量增加速度减缓，直至达到吸附平衡。一般认为，在印迹聚合物对模板分子的吸附过程中，存在非特异性物理吸附和特异性吸附。在吸附初期，印迹聚合物对模板分子的吸附以非特异性物理吸附为主，吸附速度较快。当非特异性吸附部位逐渐被占据后，则以特异性吸附为主，此时溶菌酶分子需要克服一定的空间位阻效应向深孔的特异性吸附部位扩散传质，所以传质速度较慢，吸附速度较小，因此吸附量增加减慢，最后缓慢平衡。LYZMIP-PMAA/SiO2对溶菌酶分子的吸附在180 min左右达到饱和。

2.6选择性吸附性能

MIP和NIP对溶菌酶和牛血清白蛋白的选择性吸附数据见表1。

表1 MIP和NIP对溶菌酶和牛血清白蛋白的选择吸附性能Tabel 1 The selective adsorption properties of MIP and NIP on roxithromycin and erythromycin

由表1可知，ROX-MIP-PMAA/SiO2对溶菌酶的分配系数明显大于牛血清白蛋白素，其分离因子为1.20，这说明其对溶菌酶具有较好的选择吸附性能。ROX-MIP-PMAA/SiO2对竞争底物的分配系数也大于NIP-PMAA/SiO2。而NIP-PMAA/SiO2对溶菌酶和牛血清白蛋白的分配系数基本相同，分离因子仅为1.01，基本没有选择吸附性能。ROX-MIPPMAA/SiO2对模板分子不仅存在非特异性物理吸附，还存在印迹空穴产生的特异性吸附，因此其对模板分子具有选择性，具有一定的分子识别性能。而NIP-PMAA/SiO2对两种底物仅具有物理吸附作用，没有选择性。

3　结论

1）采用γ-氨丙基三甲氧基硅烷（AMPS）对硅胶进行改性，然后将甲基丙烯酸接枝到AMPS-SiO2表面上，得到聚甲基丙烯酸接枝硅胶（PMAA/SiO2），再以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，在模板分子溶菌酶存在下在PMAA/SiO2表面进行交联聚合，得到溶菌酶表面分子印迹硅胶材料（ROX-MIP-PMAA/ SiO2）。采用红外、电镜扫描和粒径测定等方法初步表征了ROX-MIP-PMAA/SiO2的结构。

2）静态和动态吸附试验研究表明，LYZ-MIP-PMAA/ SiO2对溶菌酶的吸附性能明显大于NIP-PMAA/SiO2。

3）选择性吸附试验结果表明，LYZ-MIP-PMAA/SiO2对溶菌酶和牛血清白蛋白的分离因子为1.20，说明其对溶菌酶具有较好的选择吸附性能，而NIP-PMAA/ SiO2对溶菌酶和牛血清白蛋白基本没有选择性。

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Study on Preparation of Lysozyme Molecularly Imprinted Materials and Its Adsorption Properties

LI Pei-xu
（School of Comprehensive Education，Weifang University of Science and Technology，Shouguang 262700，Shandong，China）

Abstract：Silica was modified with AMPS，and then polymethacrylic acid was grafted onto AMPS -SiO2surface，forming polymethacrylic acid grafted silica gel（PMAA/SiO2）. With lysozyme as template molecule and ethylene glycol dimethacrylate as crosslinker，LYZ-imprinted polymeric layer was prepared and silica surface was coated with it（LYZ-MIP-PMAA/SiO2）. The material was characterized by scanning electron microscope （SEM）and particle size analysis. Infrared spectroscopy，scanning electron microscopy and particle size determination were used to characterize LYZ-MIP-PMAA/SiO2. The adsorption properties of LYZ-MIP-PMAA/ SiO2on lysozyme were studied by static binding test and dynamic binding test，and its selective adsorption properties was investigated by selective binding test with bovine serum albumin as competing substrate. Results showed that the adsorption capacity of LYZ-MIP-PMAA/SiO2on lysozyme was better than that of NIP-PMAA/ SiO2. The separation factor of LYZ-MIP-PMAA/SiO2on lysozyme and bovine serum albumin was 1.20，showing that LYZ-MIP-PMAA/SiO2displayed high recognition ability to the template molecule-LIN.

Key words：silicone；lysozyme；surface imprinted；adsorption property

收稿日期：2015-08-25

作者简介：李培绪（1976—），男（汉），讲师，硕士研究生，从事功能高分子材料研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.009