乌塌菜与薹菜变种间杂交后代硫代葡萄糖苷组分及含量分析

冯希环 孙 艳 刘倩倩 汪俏梅 刘维信*

（1青岛农业大学园艺学院，青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东青岛 266109；2浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室，浙江杭州 310029）

乌塌菜与薹菜变种间杂交后代硫代葡萄糖苷组分及含量分析

冯希环1孙 艳1刘倩倩1汪俏梅2刘维信1*

（1青岛农业大学园艺学院，青岛市园艺植物遗传改良与育种重点实验室，山东青岛 266109；2浙江大学园艺系，农业部园艺植物生长发育与生物技术重点开放实验室，浙江杭州 310029）

以乌塌菜品种上海小八叶、薹菜品种平度薹菜及变种间杂交后代6-1和6-5为试材，采用高效液相色谱法（HPLC）分析叶片及叶柄中硫代葡萄糖苷的组分与含量，以期了解不结球白菜变种间杂交后代的硫苷变化。结果表明：4份材料的叶片、叶柄中均检测到组分相同的脂肪族硫苷、吲哚族硫苷各4种，而芳香族硫苷只在变种间杂交后代6-1的叶片和叶柄中检测到；参试各材料叶片中总脂肪族硫苷含量、总吲哚族硫苷含量和总硫苷含量均高于叶柄。变种间杂交后代6-1叶片、叶柄中有益人体健康的2-苯乙基硫苷（NAS）和吲哚-3-甲基硫苷（GBC）含量均高于亲本上海小八叶和平度薹菜，表明变种间杂交可以用于改良不结球白菜硫苷组分及含量。

乌塌菜；薹菜；变种间杂交；硫代葡萄糖苷；高效液相色谱法

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，简称硫苷）又称黑芥子苷、芥子油苷，广泛存在于十字花科植物中，是一种含硫的次生代谢物质（Halkier & Gershenzon，2006）。在植物体中已鉴定出逾120种硫苷，根据侧链R基团的不同可以分为3类：脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷。硫苷及其降解产物与抵御病虫害、构成十字花科蔬菜特殊风味以及抗癌作用等密切相关（Giamoustaris & Mithen，1995；Murillo & Mehta，2001；Tierens et al.，2001；Lankau，2007）。大量研究表明，食用芸薹属蔬菜可以降低癌症的发生率（Nijhoff et al.，1995；Tawfiq et al.，1995；宋曙辉和薛颖，1997；汪俏梅和曹家树，2001；王永飞 等，2004；Maria & Richard，2009）；但脂肪族硫苷、吲哚族硫苷、芳香族硫苷的抗癌活性及其作用机理不同（袁高峰等，2009）。硫苷及其降解产物的生物学效应在植物学、医学、食品科学等许多领域中引起研究者的关注；同时，改变芸薹属蔬菜硫苷组分、提高其有益硫苷含量也成为蔬菜育种的新目标。

目前，硫苷与白菜类蔬菜风味形成关系的研究较深入。白菜类蔬菜风味的形成来源于3-丁烯基硫苷（gluconapin，NAP）、4-戊烯基硫苷（glucobrassicanapin，GBN）和苯乙基硫苷（gluconasturtiin，GNST）降解产生相应的异硫氰酸酯化合物（何洪巨 等，2002）。研究发现，3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷在所有白菜基因型中含量丰富（Padilla et al.，2007；Kim et al.，2010；Cartea et al.，2012）。Kliebenstein等（2001）报道，AOP2是控制3-丁烯基硫苷和4-戊烯基硫苷生成的关键基因。王辉等（2011a）推测，BrAOP可能是控制白菜中3-丁烯基硫苷生物合成的关键候选基因。硫苷的组分与含量在芸薹属不同植物种类间表现出很大变异（Rosa et al.，1997；李鲜 等，2006），这为选育高硫苷含量以及不同硫苷组分的白菜类蔬菜新品种奠定了基础。起源于中国的白菜亚种的两个变种——薹菜〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort〕和乌塌菜〔Brassicacampestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee〕是黄淮中下游地区深受群众喜爱并广泛栽培的特色蔬菜，关于薹菜的硫苷含量及组分已有报道（何洪巨 等，2002；宋延宇 等，2008），但鲜有关于乌塌菜硫苷组分的报道。笔者在前期分析不结球白菜种质资源时发现薹菜与乌塌菜硫苷含量以及组分均存在显著差异（孙艳，2013），为探讨通过变种间杂交选育不同硫苷含量及组分的白菜类蔬菜新品种的可行性，本试验比较了乌塌菜品种上海小八叶和薹菜品种平度薹菜与它们的杂交后代间叶片、叶柄中硫苷组分及含量的变化。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试薹菜品种为平度薹菜自交系，乌塌菜品种为上海小八叶自交系，是青岛农业大学白菜课题组分别从山东青岛地方品种平度薹菜和上海地方品种上海小八叶经连续6代自交选育而成的亲本材料。育种系6-1和6-5是由平度薹菜自交系与上海小八叶自交系杂交产生F1，再以上海小八叶自交系为轮回亲本连续回交4代，在回交后代的自交群体中（BC4F2）筛选出的2个优良株系。

上述4份材料均于2014年9月1日播种于青岛农业大学试验田，10月9日定植，株距18 cm，行距20 cm，每小区30株，随机区组排列，3次重复。11月9日取样，每小区随机选取5株，叶片与叶柄分别用液氮迅速冷冻，真空冷冻干燥（Virtis，USA）后研磨成粉末，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.2 硫苷组分及含量分析

参照Jia等（2009）的方法，取0.1 g冻干粉于15 mL离心管中，加入5 mL ddH2O，沸水浴10 min后3 000 r·min-1离心10 min，采用Eppendorf移液器吸出提取液；再加入5 mL ddH2O，沸水浴10 min，再次离心（3 000 r·min-1，10 min），合并提取液，置于-20 ℃冰箱保存。

通过DEAE-Sephadex将提取液柱吸附、洗脱，得到纯化样品，过滤后进行HPLC（Waters，USA）分析。HPLC条件：检测波长为226 nm，流速为110 mL·min-1，色谱柱为C18反相色谱柱。以oNPG为内标（响应因子为0.17），采用内标法计算硫苷含量。

1.3 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2003软件进行处理。

2 结果与分析

2.1 乌塌菜、薹菜及变种间杂交后代叶片和叶柄中硫代葡萄糖苷构成

由图1和表1、2可知，4份参试材料的叶片和叶柄中都检测到了组分相同的4种脂肪族硫苷和4种吲哚族硫苷，其中4种脂肪族硫苷为：顺-2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）、5-甲基亚硫酰基戊基硫苷（5MSOP）、3-丁烯基硫苷（NAP）和4-戊烯基硫苷（GBN）；4种吲哚族硫苷为：4-羟基-3-吲哚基甲基硫苷（4OH）、吲哚-3-甲基硫苷（GBC）、4-甲氧吲哚-3-甲基硫苷（4ME）和1-甲氧吲哚-3-甲基硫苷（NEO）。而芳香族硫苷仅检测到1种，即2-苯乙基硫苷（NAS），且只在变种间杂交后代6-1中检测到，亲本上海小八叶和平度薹菜中均未检测到。

图1 上海小八叶叶片中硫代葡萄糖苷检测HPLC图谱

2.2 乌塌菜、薹菜及变种间杂交后代叶片和叶柄中脂肪族硫苷含量

由表1、2可知，上海小八叶、平度薹菜和变种间杂交后代6-5的叶片和叶柄中的脂肪族硫苷含量均超过了总硫苷含量的50%，而变种间杂交后代6-1叶柄中的脂肪族硫苷含量只占总硫苷含量的35.33%；其中，6-5叶柄中的总脂肪族硫苷含量明显高于其他3份材料。在参试材料所含的4种脂肪族硫苷中，PRO含量在上海小八叶、平度薹菜和6-1的叶片和叶柄中均为最低；而GBN含量占总硫苷含量的比例均为最高（除平度薹菜叶片外），其中上海小八叶叶片中GBN含量超过了总硫苷含量的50%。

2.3 乌塌菜、薹菜及变种间杂交后代叶片和叶柄中吲哚族硫苷含量

比较两个亲本材料可以看出，尽管平度薹菜的总吲哚族硫苷含量低于上海小八叶，但占总硫苷含量的比例却高于上海小八叶，分别是后者的2.00倍（叶片）和1.44倍（叶柄）。而2份变种间杂交后代的总吲哚族硫苷含量的占比则出现明显分化，6-1的总吲哚族硫苷含量的占比较高，与平度薹菜接近；6-5的总吲哚族硫苷含量的占比则低于上海小八叶（表1、2）。

2.4 乌塌菜、薹菜及变种间杂交后代叶片和叶柄中芳香族硫苷含量

在4份参试材料中，只有变种间杂交后代6-1的叶片和叶柄中检测到芳香族硫苷NAS，叶片中的含量是叶柄中的2.05倍（表1、2）。

表1 乌塌菜、薹菜及变种间杂交后代叶片中硫代葡萄糖苷组成与含量

表2 乌塌菜、薹菜及变种间杂交后代叶柄中硫代葡萄糖苷组分及含量

3 结论与讨论

本试验结果表明，参试4份材料叶片中的总硫苷含量均高于叶柄，与陈新娟等（2006）、宋延宇等（2008）的报道一致。变种间杂交后代6-1和6-5叶片中总硫苷含量介于双亲之间，6-1叶柄中总硫苷含量也介于双亲之间，但6-5叶柄中总硫苷含量高于双亲，表明乌塌菜与薹菜杂交后代的总硫苷含量发生了变化。

本试验中，亲本与变种间杂交后代的叶片和叶柄中的NAP、GBN含量均较高；除平度薹菜叶片外，其余材料的脂肪族硫苷中均以GBN所占比例最高。王辉等（2011b）测定了64份普通白菜DH系材料硫苷成分的构成及含量，发现不同季节种植的普通白菜中NAP的占比平均在50%左右，GBN则平均未超过30%。本试验中上海小八叶叶片和叶柄中GBN的占比均高于45%，变种间杂交后代6-5也获得了上海小八叶该硫苷组分占比较高的性状。

另一值得关注的是PRO，作为特殊风味物质前体（van Doorn et al.，1998），可能是致甲状腺肿素5-乙烯唑烷-2-硫酮的前体（Heaney & Fenwick，1995），但亦有相反结果的报道（McMillan et al.，1986）。本试验中变种间杂交后代6-5的PRO含量明显高于两个亲本，而6-1与两亲本相近。

本试验检测到变种间杂交后代的硫苷组分较之亲本不同，尤其是部分有益于人体健康的硫苷组分得以增加。芳香族硫苷NAS是芸薹属蔬菜的重要风味物质，其降解产物异硫氰酸盐对白血病细胞增殖有显著抑制作用（Adesida et al.，1996）。NAS在上海小八叶和平度薹菜中均未检出，但6-1的叶片〔0.78 μmol·g-1（DW）〕和叶柄〔0.38 μmol·g-1（DW）〕中的NAS含量高于薹菜、芜菁和普通白菜（宋廷宇 等，2008；孙文彦 等，2009；王辉 等，2011b），表明乌塌菜和薹菜杂交使部分后代的芳香族硫苷含量得到明显提高。

另据报道，GBC的降解产物吲哚-3-甲醇具有一定的抗癌活性（Rosa & Heaney，1993）。本试验中，变种间杂交后代6-1叶片中GBC含量高于亲本上海小八叶和平度薹菜。

本试验中乌塌菜与薹菜变种间杂交后连续回交，获得的新品系在总硫苷含量和组分上均与亲本不同，尤其是部分有益于人体健康的硫苷组分（NAS、GBC）得以增加，这可能与杂交导致的基因重组有关。新品系因硫苷组分变化获得有益于人体健康的特性以及风味的变化有待于进一步验证。

陈新娟，朱祝军，杨静，刘永华．2006．芥蓝叶和薹的硫苷组分及含量．园艺学报，33（4）：741-744．

何洪巨，陈杭，Schnitzler W H．2002．芸薹属蔬菜中硫代葡萄糖苷鉴定与含量分析．中国农业科学，35（2）：192-197．

李鲜，陈昆松，张明方，Mosbah K M．2006．十字花科植物中硫代葡萄糖苷的研究进展．园艺学报，33（3）：675-679．

宋曙辉，薛颖．1997．十字花科蔬菜防癌作用的初步研究．中国肿瘤，6（1）：19-20．

宋廷宇，侯喜林，何启伟，吴春燕，徐苑芳．2008．薹菜中硫代葡萄糖苷的鉴定与含量分析．园艺学报，35（8）：1161-1166．

孙文彦，何洪巨，张宏彦，张福锁．2009．不同品种芜菁地上部和根部硫代葡萄糖苷组分及含量．中国蔬菜，（4）：35-39．

孙艳．2013．薹菜肉质根的遗传生理及种质创新研究〔硕士论文〕．青岛：青岛农业大学．

王辉，孙日飞，邓杰，武剑，王晓武．2011a．控制白菜3-丁烯基硫代葡萄糖苷积累的QTL定位及分析．园艺学报，38（7）：1283-1290．

王辉，廖永翠，徐东辉，孙日飞，武剑，王晓武．2011b．普通白菜叶片中硫代葡萄糖苷的季节性变化．中国蔬菜，（10）：35-40．

王永飞，马三梅，聂红．2004．蔬菜的抗癌作用研究进展．北方园艺，（2）：7-8．

汪俏梅，曹家树．2001．芥子油苷研究进展及其在蔬菜育种上的应用前景．园艺学报，28（s）：669-675．

袁高峰，陈思学，汪俏梅．2009．芥子油苷及其代谢产物的生物学效应研究与应用．核农学报，23（4）：664-668.

Adesida A，Edwards L G，Thornalley P J．1996．Inhibition of human leukaemia 60 cell growth by mercapturic acid metabolites of phenylethyl isothiocyanate．Food and Chemical Toxicology，34：385-392．

Cartea M E，de Haro A，Obreg ó n S，Soengas P，Velasco P．2012．Glucosinolate variation in leaves of Brassica rapa crops．Plant Foods for Human Nutrition，67：283-288．

Giamoustaris A，Mithen R．1995．The effect of modifying the glucosinolate content of leaves of oilseed rape（Brassica-napus ssp. oleifera）on its interaction with specialist and generalist pests．Annals of Applied Biology，126（3）：347-363．

Halkier B A，Gershenzon J．2006．Biology and biochemistry of glucosinolates．Annual Review of Plant Biology，57：303-333．

Heaney R K，Fenwick G R．1995．Natural toxins and protective factors in Brassica species，including rapeseed．Natural Toxins，3（4）：233-237．

Jia C G，Xu C J，Wei J，Yuan J，Yuan G F，Wang B L，Wang Q M．2009．Effect of modified atmosphere packaging on visual quality and glucosinolates of broccoli florets．Food Chemistry，114：28-37．

Kim J K，Chu S M，Kim S J，Lee D J，Lee S Y，Lim S Y，Ha S H，Kweon S J，Cho H S．2010．Variation of glucosinolates in vegetable crops of Brassica rapa L. ssp. pekinensis．Food Chemistry，119：423-428．

Kliebenstein D J，Lambrix V M，Reichelt M，Gershenzon J，Mitchell-Olds T．2001．Gene duplication in the diversification of secondary metabolism：tandem 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases control glucosinolate biosynthesis in Arabidopsis．The Plant Cell，13（3）：681-693．

Lankau R A．2007．Specialist and generalist herbivores exert opposingselection on a chemical defense．New Phytologist，175：176-184．

Maria T，Richard M．2009．Glucosinolates，isothiocyanates and human health．Phytochemistry Reviews，8（1）：269-282．

McMillan M，Spinks E A，Fenwick G R．1986．Preliminary observations on the effect of dietary Brussels sprouts on thyroid function．Human Toxicology，5（1）：15-19．

Murillo G，Mehta R G．2001．Cruciferous vegetables and cancer prevention．Nutrition & Cancer，41（1-2）：17-28．

Nijhoff W A，Grubben M J A L，Nagengast F M，Jansen J B M J，Verhagen H，van Poppel G，Peters W H M．1995．Effects of consumption of Brussels sprouts on intestinal and lymphocytic glutathione s-transferases in humans．Carcinogenesis，16（9）：2125-2128．

Padilla G，Cartea M E，Velasco P，de Haro A，Ord á s A．2007．Variation of glucosinolates in vegetable crops of Brassica rapa．Phytochemistry，68：536-545．

Rosa E A S，Heaney P K．1993．Glucosinolates in crop plants．Journal of Science of Food and Agriculture，62：259-265．

Rosa E A S，Heaney R K，Fenwick G R，Portas C A M．1997．Glucosinolates in crop plants．Horticultural Reviews，19：99-215．

Tawfiq N，Heaney R K，Plumb J A，Fenwick G R，Musk S R，Williamson G．1995．Dietary glucosinolates as blocking agents against carcinogenesis：glucosinolate breakdown products assessed by induction of quinone reductase activity in murine hepa1c1c7 cells．Carcinogenesis，16：1191-1194．

Tierens K，Thomma B，Brouwer M，Schmidt J．2001．Study of the role of antimicrobial glucosinolate-derived isothiocyanates in resistance of Arabidopsis to microbial pathogens．Plant Physiology，125：1688-1699．

van Doorn H E，van der Kruk G C，van Holst G J，Raaijmakers-Ruijs N C M E，Postma E，Groeneweg B，Jongen W H F．1998．The glucosinolates sinigrin and progoitrin are important determinants for taste preference and bitterness of Brussels sprouts．Journal of the Science of Food and Agriculture，78（1）：30-38．

Analysis of Glucosinolates Composition and Content in Filial Lines Derived from Inter-Varietal Cross of Savoy and Tai-tsai by HPLC

FENG Xi-huan1，SUN Yan1，LIU Qian-qian1，WANG Qiao-mei2，LIU Wei-xin1*
（1College of Horticulture，Qingdao Agricultural University，Qingdao Key Laboratory of Genetic Improvement and Breeding in Horticultural Plants，Qingdao 266109，Shandong，China；2Department of Horticulture，Zhejiang University，Key Laboratory of Horticultural Plant Growth，Development and Quality Improvement，Ministry of Agriculture，Hangzhou 310029，Zhejiang，China）

To understand the variation of glucosinolates composition in backcrossing lines derived from inter-varietal crosses in pakchoi，the content and composition of glucosinolates were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC）for savoy〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. rosularis Tsen et Lee〕cv.‘Shanghaixiaobaye’，tai-tsai〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）Makino var. tai-tsai Hort〕cv.‘Pingdutaicai’，and 2 lines selected from F2populations of 4 times backcrossing of（‘Shanghaixiaobaye’בPingdutaicai’）with‘Shanghaixiaobaye’as the recurrent parent．The results showed that each of 4 kinds of aliphatic and indole glucosinolate were detected in the leaf and petiole of 4 tested materials．The total contents of aliphatic glucosinolate，indole glucosinolate and total glucosinolate in leaves were higher than petioles，and also different with 4 tested materials．The contents of health-beneficial compounds 2-phenylethyl glucosinolate（NAS）and glucobrassicin（GBC）were higher in leaves of‘6-1’than both its parents‘Shanghaixiaobaye’and‘Pingdutaicai’，indicating that inter-varietal crosses could be used in breeding new pakchoi cultivars with improved glucosinolate composition．

Savoy；Tai-tsai；Inter-varietal cross；Glucosinolate；HPLC

冯希环，硕士研究生，专业方向：蔬菜生理与育种，E-mail：15806584583@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：刘维信，教授，硕士生导师，专业方向：白菜遗传育种，E-mail：liuweixin2006@163.com

2016-09-19；接受日期：2016-11-11

国家自然科学基金项目（31401864），山东省自然科学基金项目（ZR2016CM15），青岛市自主创新计划应用基础研究项目（16-5-1-74-jch）