腈水解酶固定化的研究进展

黄季维，邹树平，郑裕国（1.浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014；2.生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江杭州310014）



腈水解酶固定化的研究进展

黄季维1,2，邹树平1,2，郑裕国1,2
（1.浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014；
2.生物转化与生物净化教育部工程研究中心，浙江杭州310014）

摘要：腈水解酶在医药及其中间体、农药及其中间体、食品、饲料添加剂等精细化学品工业生产中具有十分广泛的应用。固定化腈水解酶便于贮存和重复利用，有利于产物分离和连续化生产。介绍了常用的腈水解酶固定化方法，如包埋法、吸附法、共价法、交联法以及新型固定化方法，如膜截留固定化法、定向固定化法。这些固定化方法对提高腈水解酶稳定性和重复使用批次起着重要的作用。

关键词：腈水解酶；固定化；研究进展

腈水解酶催化的水解反应条件温和、催化效率高、选择性好、产物的光学纯度高、对环境污染小且符合原子经济和绿色化学的理念。固定化生物催化剂有利于大规模的生物转化过程的连续化，提高酶的稳定性，增强使用效率，降低生产成本。同时，催化剂的固定化有助于产物的分离提取，降低了下游过程的分离成本，保障产品的质量。越来越多学者对腈水解酶固定化方法进行了研究，以期提高腈水解酶的稳定性和重复使用性，使之更适合于大规模的工业化应用。以下就几种常用的腈水解酶固定化方法作一一介绍。

1　包埋固定化法

包埋法反应条件温和、有较高的酶包埋量、酶蛋白结构不会遭到破坏、酶活回收率高，且对大多数酶、粗酶制剂甚至微生物细胞都可以进行包埋固定化，是应用最广泛的固定化方法。

1.1海藻酸钠包埋

海藻酸与二价以上的盐类形成不溶性盐，由此可形成耐热性凝胶或被膜，这是海藻酸固定化凝胶形成的最重要特性，一般用钙离子与海藻酸根螯合形成海藻酸钙凝胶。海藻酸钠完全无毒，相比其他高分子材料更为清洁，同时海藻酸钠不能被绝大多数微生物分解或作为底物，所以是一种理想的生物固定化载体。

Almatawah等［1］利用海藻酸钙包埋腈水解酶细胞Bacillus pallidus Dac521，在50 g/L海藻酸钠，24 mg/mL细胞浓度，0.1 mol/L氯化钙和pH 8.0 Tris-HCl缓冲液固定化条件下，其酶活回收率高达98%。在小型流化床中连续合成烟碱酸，100 mmol/L底物浓度下连续使用10个批次后酶活残留70%。与游离细胞相比，固定化细胞在60℃下温度稳定性得到明显提高。然而单纯用海藻酸钠珠子包埋细胞存在机械强度低，反应过程中珠子容易破裂等问题，一些科研人员对常见材料复合固定化进行了研究。考虑到海藻酸钠质脆且耐水性较差，重复使用性不好等问题，柳志强等［2］利用聚乙烯醇的亲水性基团以及强韧性来提高海藻酸钠的抗水性能和改善质脆的缺点。将海藻酸钠结合聚乙烯醇复合包埋腈水解酶全细胞应用于亚氨基二乙酸的生产。在10 g/L海藻酸钠溶液，80 g/L聚乙烯醇溶液、10 g/L氯化钙溶液和5 g/L湿细胞浓度下酶活回收率达到98.1%，在75 mmol/L底物浓度下使用10批后酶活残留40%。同样由于聚乙二醇具有广泛的相容性，较高的稳定性和不易变质的特点，金利群等［3］在25 g/L海藻酸钠溶液，100 g/L聚乙二醇溶液，60 g/L细胞悬浮液和25 g/L氯化钙溶液条件下复合包埋腈水解酶全细胞。结果表明酶活回收率80%以上，在40 mmol/L底物浓度下合成蛋氨酸羟基类似物，连续操作100 h后酶活残留80%，产物纯度达到99.1%，总收率达到97%。此外由于壳聚糖具备较高的生物相容性、化学稳定性、无毒的特点，许正宏等［4］利用聚乙烯醇-壳聚糖为复合材料固定化产腈水解酶的赤霉菌。在30 g/L聚乙烯醇溶液、60 g/L壳聚糖溶液固定化条件下酶活回收率高达100%。在100 mmol/L底物浓度下生产烟酸可连续操作25个批次。除此之外包埋结合交联法也能进一步提高固定化细胞的稳定性。薛亚平等［5］将此方法应用于Alcaligenes faecalis ZJUTB10腈水解酶全细胞固定化中，在20 g/L海藻酸钠溶液，10 g/L氯化钙溶液，2 g/L PEI-HCl和1%（体积比）GA条件下制备固定化细胞。酶活回收率为45.8%，在20 mmol/L底物浓度下连续生产R-（-）-扁桃酸重复使用19批次后酶活残留90%，在填充床中反应16 h，时空产率达到8.87 mmol/（L·h），最终经过80 h，R-（-）-扁桃酸积累量达到550 mmol/L，e.e.＞99%。

1.2琼脂糖包埋

琼脂是由海藻中提取的多糖体，具有凝固性、稳定性，能与一些物质形成络合物等物理化学特性，可用作增稠剂、凝固剂、稳定剂等。琼脂主要由琼脂糖和琼脂果胶组成，其中琼脂糖是线性多聚物，在水中一般加热到90℃以上溶解，温度下降到35～40℃时形成良好的半固体状的凝胶，它具有良好的生物相容性，一般利用这些性质作为细胞溶胶-凝胶的固定化载体。Nigam等［6］采用琼脂糖包埋腈水解酶细胞Streptomgces sp. MTCC7546，琼脂糖浓度为20 g/L，制成直径为4 mm，含有干细胞重量为0.001 g的珠子，在100 mmol/L底物浓度下连续生产丙烯酸25批次后酶活残留65%。

1.3聚乙烯醇包埋

聚乙烯醇（PVA）是聚醋酸乙烯酯的水解产物，它对水的溶解性与醇解度、聚合度和温度有关。一般情况下醇解度越高，浓度越高，聚合度越大，温度越低则PVA水溶液黏度越大。Bauer等［7］采用聚乙烯醇包埋腈水解酶细胞Rhodococcus sp. ATCC39484。当细胞浓度为1 g/mL以及PVA浓度为200 g/L时，在饱和硼酸溶液中保存2 h，酶活回收率高达100%，在填充床上实现了100 mmol/L底物浓度下连续反应100 min制备丙酸。

1.4卡拉胶包埋

卡拉胶是从海藻中提取出来的一种多糖，它的产品一般为灰白或浅黄褐色的粉末，无臭无味，具有特殊的凝固性。使用卡拉胶作为载体具有操作简单、活性高、半衰期长、机械强度好等优点。Cooling等［8］利用卡拉胶包埋Acidovorax facilis 72w腈水解酶细胞并结合聚乙烯亚胺和戊二醛交联，在0.05 g/mL卡拉胶，1.1 g/mL细胞浓度，0.008 g/ mL GA（0.25 g/mL）和0.036 g/mL PEI（0.11%g/ mL）条件下制得固定化细胞，在150 mmol/L底物浓度下经过67次循环，4-氰基戊酸铵盐浓度达到1.3 mol/L，使用4批后酶活残留80%。

1.5邻苯二酚-壳聚糖包埋

Ni等［9］发明这种新型材料通过二羟基苯甲醛上的醛基与壳聚糖上的氨基发生席夫碱反应生成邻苯二酚壳聚糖溶液，然后将邻苯二酚溶液加入菌悬液使细胞聚集，随着pH上升将腈水解酶全细胞E. coli M15/BCJ2315包埋，所得固定化细胞用于连续生产R-（-）-扁桃酸，在1 mg/mL邻苯二酚壳聚糖溶液，0.005 g/mL细胞浓度以及pH 7.0固定化条件下酶活回收率达到76.3%，在100 mmol/L底物浓度下连续使用16个批次后酶活残留80%，而且相对于游离细胞在35～55℃范围内明显提高了其温度稳定性，在pH 6～10范围内明显提高了其pH稳定性。

1.6二氧化硅包埋

Swartz等［10］利用仿生硅化法设计了一种快速生成氧化硅纳米颗粒包埋腈水解酶的工艺，利用四甲氧基硅烷作为氧化硅的前驱体，使用树枝状高聚大分子（PAMAM）介导的仿生硅化将腈水解酶包埋于氧化硅纳米颗粒中。当酶和氧化硅比例为0.86时，经过仿生固定化的腈水解酶酶活回收率达到92.3%，氧化硅基质不会产生底物扩散限制，在5 mmol/L底物浓度下用于连续生产烟碱酸重复使用10次后活力维持在90%。

吸附法操作简便易实现，固定化条件温和，固定化载体廉价易得且可以重复利用，但是吸附法也有缺陷，酶与载体之间结合能力弱，酶易发生脱落，导致活力下降并污染反应产物。

Vejvoda等［11］利用丁基琼脂糖柱吸附菌株Aspergillus niger k10，流动相和洗脱液均为0.8 mol/L的硫酸铵溶液，吸附和洗脱流速分别为0.25 mL/min和0.5 mL/min。此条件下酶的负载量相对未吸附前提高了18倍，实现了高的转化率。在

2　吸附固定化法

10 mmol/L底物浓度下合成烟碱酸，连续使用19批次后酶活残留80%。

3　共价固定化法

酶的氨基、羧基、酚基、巯基、羟基、咪唑基等功能基团可以参与共价结合，其中以氨基和羧基的结合法最为常见，通常该方法得到的固定化酶中酶与载体之间结合牢固，不易发生酶脱落现象，但是酶蛋白高级结构易在比较剧烈的反应条件下遭到破坏。周小华等［12］发明了一种制备固定化酶的方法，以D155树脂为基体，通过二环己基碳二亚胺与赖氨酸缩合，制备出L-D155树脂，再以L-D155树脂为载体，通过戊二醛分别与载体和腈水解酶形成席夫碱制备固定化腈水解酶，当树脂：菌悬液体积：戊二醛体积为1 g：2.5 mL：0.7 mL时，酶活回收率达到60%，相对于游离酶其热稳定性明显提高，且连续生产R-（-）-扁桃酸5个批次后酶活残留85%。

4　交联固定化法

交联法制备的固定化细胞或酶稳定性良好，可使用时间长，但是由于交联反应条件剧烈，酶分子的多个基团被交联，导致酶活损失比较大［34］。戊二醛是最常见的交联剂，它是通过具有双功能醛基的小分子物质能够与细胞或酶上的官能团氨基发生席夫碱反应将细胞或酶交联，进而达到稳定细胞或酶结构的目的。张志军等［13］用戊二醛直接交联腈水解酶全细胞E. coli，当细胞浓度为8 g/ L，戊二醛浓度为70 mmol/L，交联时间为20 min时，酶活回收率达到85%。在100 mmol/L底物浓度下生产R-（-）-扁桃酸，反应15批后活力无明显损失，在30、40、50℃条件下相对游离细胞半衰期分别提高4.5、5.3、5.1倍。Kaul等［14］用85%异丙醇沉淀酶，然后加入30 mmol/L戊二醛交联酶聚体制备固定化酶，酶活回收率达到80%。在10 mmol/L底物浓度下重复使用5个批次，酶活残留90%，相对酶在可溶性状态下的交联过程，将酶沉淀出来后再交联其固定化酶活力在30、60℃条件下提高了5倍。

5　其他固定化方法

除了上述所述的固定化方法，还有膜截留固定化法，即酶可以被半透膜、中空纤维膜、超滤膜等截留而产物可以透过的固定化方式。这种固定化方法成本低廉、操作简单、条件温和、无内扩散影响，克服了传统技术中存在的严重传质受限等问题，具有良好的生物相容性。金属螯合载体定向固定化即利用金属螯合配体表面的金属离子（Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+等过渡金属离子）与蛋白质表面供电子氨基酸残基（特别是组氨酸）以配位作用紧密结合，从而将酶固定到载体的表面。这种方法具有酶与载体之间结合牢固、结合位置单一的特点，对酶分子来说是理想的固定化结合位点。吴洋等［15］以琼脂粉为基质制备金属螯合载体并用于固定重组腈水解酶。研究发现制备金属螯合载体最合适的金属离子为Zn2+，当Zn2+浓度为0.3 mol/L，添酶量为15.6 mg/g，固定化pH为8.0，温度为40℃时，制备的固定化酶活性最优，在100 mmol/L底物浓度下生产R-（-）-扁桃酸使用8批后活力保持在45%。

6　展望

腈水解酶是一个非常具有工业化应用价值的酶。生物催化剂的固定化有利于大规模生物催化过程的连续化、提高生物催化剂的操作稳定性和使用效率，方便产物提取纯化，降低生产成本。目前腈水解酶/细胞的固定化还面临着载体基质传质受限制，以及载体机械强度不高导致操作稳定性较差等问题。这些因素限制了其在大规模生产中的应用。因此，在今后的研究中可以从腈水解酶固定化方法上加以改进，如开发降低传质限制的无载体固定化技术，增加酶和载体专一性的定向共价固定化技术等。

参考文献：

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（责任编辑：朱小惠）

Research progress in the immobilization of nitrilase

HUANG Jiwei1，2，ZOU Shuping1，2，ZHENG Yuguo1，2

（1. Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China；

2. Engineering Research Center of Bioconversion and Biopurification of the Ministry of Education，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Abstract：Nitrilase is widely used in industrial biocatalytic synthesis of pharmaceuticals and their intermediates，agrochemicals，food additives，and other fine chemicals. Its immobilization not only solves the problems of long-time storage and reuse，but also be conducive to products separation and continuous production. In this paper，the commonly used immobilization methods of nitrilase are introduced，including embedding，adsorption，covalent binding and cross-linking. Moreover，some newly developed immobilization methods in recent years such as membrane intercept immobilization，orientation-controlled immobilization are also described. These methods play an important role in improving the stability and reusability of nitrilase.

Keywords：nitrilase；immobilization；research progress

作者简介：黄季维（1988—），男，四川自贡人，硕士，研究方向为生物催化与转化，E-mail：hjw_5566@sina.com.通信作者：郑裕国教授，E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn.

基金项目：国家自然科学基金（21176224）

收稿日期：2015-04-29

中图分类号：Q814.2

文献标志码：A

文章编号：1674-2214（2016）02-0114-04