漆酶降解烟梗木质素的条件优化

李 晓，顾小燕，丁美宙，王海滨，周利军

（1．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450000；2．河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南郑州450000）

漆酶降解烟梗木质素的条件优化

李 晓1，顾小燕1，丁美宙2，王海滨2，周利军1

（1．郑州轻工业学院食品与生物工程学院，河南郑州450000；2．河南中烟工业有限责任公司技术中心，河南郑州450000）

为提高梗丝的吸味品质、将梗丝木质素降解成小分子化合物，采用单因素试验和多因素试验相结合的方法研究酶解温度、酶解时间和漆酶用量对梗丝木质素降解效率的影响及酶解最适条件优化。结果表明：1）梗丝木质素的降解率随酶解温度的升高呈先升后降趋势，在62℃时降解率较高，为48．16%，与其他温度处理差异显著；2）随酶解时间的增长梗丝木质素的降解率呈上升趋势，在7h、8h和9h时降解率较高，三者均超过60%，与其他处理差异显著；3）随漆酶用量的增加梗丝木质素的降解率逐渐增大，在用量为0．55μL／g和0．65μL／g时降解率较高，分别为41．76%和46．80%，显著高于其他处理，但二者之间无显著差异。4）在酶解条件分别为62℃、8h、0．55μL／g时，漆酶降解梗丝木质素的降解效果最好，降解率为66．52%。

梗丝；木质素；漆酶；降解率

烟梗是烟叶的重要组成部分，约占烟叶总重的25%［1］。由烟梗制成的梗丝具有较强的支撑作用，不仅能提高梗丝的填充能力，还能增加燃吸时空气的透过量、提高烟支的燃烧性［2］，但梗丝在吸食过程中往往使人感到杂气和木质气重、灼喉等不适，其所含木质素被认为是造成该感官缺陷的主要原因［3－8］。纤维素是梗丝中木质素含量较低且对梗丝形态完整性具有重要维持作用的组成部分［9］。因此，对梗丝木质素进行降解，既不会破坏梗丝的高填充性，还能大幅度提高其感官品质。

对木质素的降解，有理化方法、生物方法等多种途径。关于生物方法降解木质素，国内外已有大量的研究报道［10－17］，与理化方法相比，生物方法具有使用方便、污染小，使用后不需特殊处理工艺等生态优势［1822］。但在烟草行业关于采用生物方法降解梗丝木质素的研究很少。为此，笔者采用生物酶对梗丝木质素进行降解，重点研究酶解温度、酶解时间和漆酶用量对梗丝木质素降解效率的影响，并拟通过多因素试验确定梗丝木质素酶解的最适条件，以提高梗丝感官质量为重点进行技术创新，以期为解决烟梗原料使用率低，梗丝难以在中高档卷烟中有效利用及增大梗丝在卷烟配方中的使用比例，降低生产成本提供理论依据和技术支撑。

1材料与方法

1．1供试材料

1）原料。烟草梗丝，贵州地区生产；漆酶，诺维信公司生产。

2）仪器与设备。索氏提取器，冷凝回流装置，金坛市新航仪器厂生产；DHG－9145A型电热鼓风干燥箱，落地恒温振荡器，上海一恒科技有限公司生产；PL203型电子天平（感量0．001g），梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司生产。

1．2单因素降解试验

试验选取酶解温度、酶解时间和漆酶用量3个因素进行单因素试验，其中：1）酶解温度分别为60℃、61℃、62℃、63℃和64℃，酶解时间为3h，漆酶添加量为0．45μL／g。2）酶解时间分别为1h、 2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h和9h，漆酶添加量为0．45μL／g，温度为60℃。3）漆酶添加量分别为0．25μL／g、0．35μL／g、0．45μL／g、0．55μL／g和0．65μL／g，酶解温度为60℃，时间为3h。

1．3降解条件的优化

以木质素降解率为标准，根据单因素试验结果，每个因素选取2个较优水平进行多因素随机区组试验，最终确定漆酶降解梗丝木质素的最佳工艺条件。

1．4数据处理

梗丝木质素的含量用Klason法测定。试验前测定原梗丝木质素的含量，酶解试验完成后测定剩余量，最后计算梗丝木质素的降解率。试验数据为3次重复的平均值。

2结果与分析

2．1不同降解因素烟草梗丝木质素的降解率

不同降解条件下漆酶对梗丝木质素的降解率结果见图1。

图1 不同降解因素（温度、时间和添加量）漆酶对烟草梗丝木质素的降解率Fig．1 Degradation rate of laccase on lignin in the tobacco cut at different temperatures

2．1．1温度 酶的催化作用受温度的影响很大，不同温度条件下漆酶的活性有所不同，对梗丝木质素的降解效果也不同。60～62℃时，随温度的升高，梗丝木质素的降解率逐渐增大，在61℃和62℃时降解率较高，分别为43．88%和48．16%；超过62℃时，随温度的升高，酶的活性降低，降解率逐渐下降；在64℃时降解率最低，仅为29．82%。方差分析表明：温度为61℃和62℃的处理，梗丝木质素的降解率较高，二者与其他处理间的差异达极显著水平（P＜0．01），但61℃和62℃处理间差异显著（P＜0．05），故选取该2个水平进行多因素试验。

2．1．2酶解时间 随时间延长梗丝木质素的降解率明显增加，在7h时达较高水平，为62．41%；超过7h，梗丝木质素的降解率增加减缓。方差分析表明，酶解时间7h、8h和9h的降解率相差不大，分别为62．41%、63．45%和64．03%，其中，处理9h、8h与7h之间的差异显著（P＜0．05），但未达极显著水平，三者与其他处理间的差异达极显著水平（P＜0．01）。酶解时间延长直接影响生产产量，综合试验结果的方差分析和实际生产情况等因素，选取酶解时间为7h和8h进行多因素试验。

2．1．3漆酶用量 在漆酶添加量为0．25～0．45μL／g时，随着漆酶用量的增加，梗丝木质素的降解率呈上升趋势；当漆酶用量高于0．55μL／g后降解率趋于平缓。因此，加酶量继续增加，梗丝木质素的降解率不再明显增加。方差分析表明，在试验范围内漆酶用量越多，梗丝木质素的降解率越高。漆酶用量为0．55μL／g和0．65μL／g时，梗丝木质素的降解率较高，分别为41．76%和46．80%，二者间差异不显著（P＞0．05），但与其他处理间的差异达极显著水平（P＜0．01），故选取漆酶用量为0．55μL／g和0．65μL／g进行多因素试验。

2．2降解条件的优化

经过单因素试验结果分析，选出酶解温度61℃（A1）和62℃（A2），漆酶用量0．55μL／g（B1）和0．65μL／g（B2），酶解时间7h（C1）和8h（C2）等进行三因素两水平的多因素随机区组试验。由图2可知，试验条件不同，梗丝木质素的降解率也不同。其中，A1B1C2、A1B2C1、A2B1C1和A2B1C2处理梗丝木质素的降解率较低，且差异不大；A2B2C1处理梗丝木质素的降解率最高，为66．52%，且极显著（P＜0．01）高于其他处理。表明，A2B2C1处理为最佳参数组合，即在62℃、8h和0．55μL／g的条件下，漆酶降解梗丝木质素的效果最好。通过3个因素对梗丝木质素降解率影响大小的方差分析可以得出，酶解温度对梗丝木质素降解率的均方最大，为578．92，其次是酶解时间（为185．88），最后是漆酶用量（为11．89），即酶解温度对梗丝木质素降解率的影响最大，其次是酶解时间，而漆酶用量的影响最小。

图2 多因素试验漆酶对木质素的降解率Fig．2 Degradation rate of laccase on lignin in the multi－factor test

3结论与讨论

1）烟草梗丝木质素的降解率随温度升高呈先升高后下降趋势，在酶解温度为61℃和62℃条件下梗丝木质素的降解率较高，分别为43．88%和48．16%，显著高于其他处理。因此，漆酶的最适温度为61～62℃。

2）随酶解时间的延长，梗丝木质素的降解率逐渐增大，在酶解温度为7h和8h条件下梗丝木质素的降解率较高，分别为62．41%和63．45%，与其他处理存在显著差异。但是在9h条件下，梗丝木质素的降解率与8h无显著差异。因此，继续延长酶解时间，对增加梗丝木质素降解率的影响不明显。

3）随着漆酶用量的增加，梗丝木质素的降解率呈上升趋势，当加酶量高于0．55μL／g后，降解率变化不明显。在加酶量为0．55μL／g和0．65μL／g时，梗丝木质素的降解率较高，分别为41．76%和46．80%，且二者与其他处理间差异显著，但二者之间无显著差异。因此，继续增加漆酶用量，对增加梗丝木质素的降解率影响不明显。

4）多因素试验结果表明，在酶解条件为62℃、8h、0．55μL／g时，漆酶降解梗丝木质素的效果最好，降解率为66．52%。3个因素中以酶解温度对梗丝木质素降解率的影响最大。

5）本研究主要是以提高梗丝感官质量为重点进行技术创新，利用生物酶对梗丝木质素进行降解具有使用方便、安全无污染和使用后不需特殊处理工艺等生态优势。在最优条件下处理后梗丝木质素的降解率可达66．52%，梗丝木质素含量明显降低。因此，由梗丝木质素造成的感官缺陷也可明显改善，这为解决梗丝难以在高档卷烟中有效利用的问题、降低生产成本提供了理论依据和技术支撑。本研究结果仅为实验室条件下所得，若在生产上应用还需进一步调整参数；另外，没有对酶解后梗丝的感官质量进行评定和化学成分测定，此后可进一步研究。

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（责任编辑：王 海）

Optimization on Degradation Conditions of Laccase on Lignin in the Tobacco Cut

LI Xiao1，GU Xiaoyan1，DING Meizhou2，WANG Haibin2，ZHOU Lijun1
（1．Institute of Food and Biological Engineering，Zhengzhou University of Light Industry，Zhengzhou，Henan 450000；2．Technology Center，China Tobacco Henan Industrial Co．，Ltd，Zhengzhou，Henan 450000，China）

In order to improve the smoking quality of cut stem and degrade the lignin into small molecular compounds，the method of single factor and multi－factor experiments were combined to study the influence of enzyme hydrolysis temperature，hydrolysis time and the amount of laccase on the stem silk lignin degradation efficiency and the optimum conditions for enzymatic hydrolysis of lignin．Results：1）With the reaction temperature increasing，the degradation rate of lignin in cut stem increased first and then decreased．At 62℃，the degradation rate was high，48．16%，and difference was significant compared with other temperature treatments．2）Along with the growth of the enzymatic hydrolysis time，lignin，degradation rate in stems silk was on the rise．In 7h，8h，9h，the degradation rate was higher，and the three were more than 60%．Compared with other temperature treatments，the difference was significant．3）With the increase of dosage of laccase，the degradation rate increased gradually．When the dosage of laccase were respectively 0．55μL／g and 0．65μL／g，degradation rate were higher，41．76%and 46．80% respectively．And significantly higher than other treatment，but there was no significant difference between the two．4）The three－factor test，reaction temperature，reaction time and enzyme dosage paint，results show that the best enzymatic hydrolysis conditions were 62℃，8h，0．55μL／g，and the degradation rate is 66．52%．

cut stem；lignin；laccase；degradation efficiency

S509．2

A

1001－3601（2016）02－0086－0149－03

2015－06－07；2016－01－07修回

河南中烟工业有限责任公司科技项目“黄金叶中高档烟用梗丝加工技术研究”（ZW2014034）

李 晓（1967－），女，教授，硕士，从事烟草科学教学与研究。E－mail：Lixiao6712＠126．com