Notch通路在大鼠肾脏缺血再灌注损伤TLR4介导的炎症反应中的作用*

徐晓嫦，　朱　晔，　张慧涛，　陈萍祯，　郑　晶，　贾　宁，　林宇静，　李玲玲，　张　桦△

(中山大学附属第五医院 1肾内科，2病理科，3中心实验室，广东 珠海 519000)



Notch通路在大鼠肾脏缺血再灌注损伤TLR4介导的炎症反应中的作用*

徐晓嫦1，朱晔1，张慧涛1，陈萍祯1，郑晶1，贾宁1，林宇静2，李玲玲3，张桦1△

(中山大学附属第五医院1肾内科，2病理科，3中心实验室，广东 珠海 519000)

[摘要]目的： 探讨Notch通路对大鼠肾脏缺血再灌注损伤(IRI)中Toll 样受体 4(TLR4)介导的炎症反应的作用。方法: 雄性SD大鼠75只随机分为假手术组(sham组)、缺血再灌注组(IRI组)和γ-分泌酶抑制剂DAPT干预组(DAPT组)。分别于再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时点观察各组肾脏病理改变，检测血尿素氮(BUN)和血清肌酐(Scr)水平，ELISA检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)水平，免疫组化和Western blot分别检测大鼠肾脏Notch1、TLR4和NF-κB p65蛋白表达水平。结果: 在IRI组，呈现不同程度的以肾小管上皮细胞和间质损伤为主的肾脏病理改变，BUN、Scr及血清炎性因子TNF-α、IL-6含量在各时点均显著高于sham组(P<0.05)，而在DAPT干预组，在各时点肾脏病理损伤明显减轻，BUN、Scr和血清TNF-α、IL-6水平均显著低于IRI组(P<0.05)。Notch1、TLR4和NF-κB p65主要表达于肾小管上皮细胞胞质中，在sham组仅有微量表达，在IRI组则有高表达，在各时点表达与sham组相比均显著增强(P<0.05)，而在DAPT组，各因子的表达水平在各时点均较IRI组显著降低(P<0.05)。结论: 大鼠肾脏IRI出现显著的肾功能及肾脏病理改变，血清炎性因子TNF-α和IL-6水平升高，Notch1、TLR4及NF-κB p65在肾组织中表达增强；而DAPT可通过抑制Notch1活化和TLR4/NF-κB通路，抑制TLR4所介导的炎症反应，从而发挥肾脏保护作用。

[关键词]肾脏； 缺血再灌注损伤； Notch通路； Toll 样受体4； 炎症

肾缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury，IRI)在肾移植、休克等过程中不可避免，且是其重要损伤环节，也是影响移植肾早期功能恢复和长期移植效果的重要因素[1-2]。IRI发病机制复杂，而炎症反应起着重要作用[2-4]。在肾缺血缺氧过程中，血管内皮细胞和肾小管上皮细胞功能障碍，激发细胞因子、炎症细胞及因子、免疫细胞的层联反应，进而导致肾小管和间质损伤。尽管血流再通是挽救肾缺血的重要措施，但在再灌注过程中，组织的炎症损伤反而加重，故阻抑炎症因子的分泌、抑制炎症反应成为防治肾IRI的重要靶点[2-5]。

近年研究表明，Toll 样受体4(Toll-like receptor 4，TLR4)在细胞的炎症与免疫反应中扮演着重要角色。TLR4被生物配体识别及结合后，可作为“门户”蛋白活化细胞内的信号转导通路，启动机体的炎症链式反应，从而促进炎症介质的产生和释放[6-7]。而Notch信号通路在大脑[8]、肠道[9]、肝脏[10]、心脏[11]、肾脏[12]等器官的缺血再灌注炎症损伤的发生发展过程中有重要作用，抑制Notch通路可以改善缺血再灌注过程中炎症损伤[11-12]。为了探讨肾脏在IRI过程中Notch信号通路是否参与调节TLR4诱导的炎症反应水平，本实验检测了Notch1、TLR4以及核因子(nuclear factor,NF)-κB p65在大鼠肾脏IRI中的表达，同时使用抑制Notch信号通路的γ-分泌酶抑制剂DAPT进行干预，初步探讨Notch通路对大鼠肾脏IRI中TLR4介导的炎症反应的作用及可能机制。

材料和方法

1动物与试剂

1.1实验动物健康雄性、SPF级的Sprague-Dawley(SD)大鼠75只，体质量220～250 g，购于中山大学实验动物中心，合格证号为SCXK(粤)2011-0029，饲养于动物实验室SPF级环境。

1.2主要试剂及药物大鼠TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒；兔抗大鼠TLR4多克隆抗体、兔抗大鼠NF-κB p56多克隆抗体、HRP标记山羊抗兔抗体、组织蛋白抽提试剂等购自武汉博士德公司、兔抗大鼠Notch1多克隆抗体购自CST；PVDF膜购自Millipore；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)等相关试剂购自艺佳生物公司；γ-分泌酶抑制剂DAPT购自Abcam。

2方法

2.1实验分组雄性SD大鼠75只，适应性喂养1周后，随机分为假手术(sham)组、IRI组和DAPT组，每组25只。

2.2模型建立及标本采集大鼠术前禁食8 h，不禁水，10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉。常规固定、消毒、铺巾，腹正中切口，游离肾蒂，IRI组以无创小血管夹同时夹闭双侧肾蒂50 min，之后松开血管夹，血流再通。Sham组和DAPT组大鼠手术方式与IRI组相同，但sham组不用血管夹阻断血流，DAPT组于松开血管夹时予DAPT(10 μmol/kg)腹腔注射，IRI组与sham组则以等容量0.9%氯化钠注射液腹腔注射。各组分别于再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h共5个时点取血标本(腹主动脉穿刺)及肾脏标本。右肾用冰生理盐水冲洗后置液氮保存，待行Western blot检测；左肾用10%甲醛固定缓冲液固定，待制备石蜡切片。

2.3指标检测(1)全自动生化分析仪检测血清肌酐(serum creatinine, Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平；(2) ELISA法检测血清TNF-α、IL-6含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行；(3) 肾组织石蜡切片行苏木素-伊红(HE)染色后光镜下观察肾组织病理学改变；(4) 免疫组织化学法检测肾组织Notch1、TLR4和NF-κB p65的表达水平：石蜡切片常规脱蜡，梯度乙醇入水，柠檬酸盐抗原修复液高温高压修复，过氧化物酶封闭液室温孵育，滴加适当浓度 I 抗，4 ℃过夜复温后滴加 II 抗，二氨基联苯氨溶液显微镜下控制显色，复染细胞核、分化、反蓝，梯度乙醇脱水干燥，中性树胶封片。各指标均用PBS代替 I 抗作为空白对照。细胞质染色呈棕黄色为阳性结果。(5) Western blot检测肾组织Notch1、TLR4和NF-κB p56蛋白的表达：取出大鼠肾组织取出后称重，加入100 g/L 的裂解液将组织进行匀浆，匀浆转入EP管，加入PMSF(100 mmol/L)，冰浴裂解30 min，于4 ℃下12 000 r/min 离心15 min，取上清液并测定蛋白含量。取肾组织匀浆蛋白100 μg与等体积的缓冲液混合，煮沸10 min，经10% SDS-PAGE分离蛋白质，转移至硝酸纤维素膜上，2%脱脂奶粉封闭膜，室温1 h，加入兔抗大鼠Notch1(1∶1 000)、TLR4(1∶200)和NF-κB p56(1∶200)多克隆抗体，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加辣根过氧化物酶标记的 II 抗，37 ℃孵育30 min，TBST洗膜3次，化学发光试剂处理后于暗室曝光。将胶片进行扫描存档，Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。以GAPDH为内参照行光密度分析，比较目的条带/内参照条带灰度值，测定各组蛋白质的相对含量。

3统计学处理

应用SPSS 20.0 软件对数据进行处理分析。计量资料采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间的均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，多个样本均数两两之间的比较采用Bonferroni校正的t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1肾脏病理学改变

Sham组大鼠肾小球、肾小管及肾间质结构基本正常。在IRI 组，随着再灌注时间的延长呈现不同程度的肾脏病理改变，可见肾小管上皮细胞浑浊肿胀，出现水样或空泡变性，刷状缘消失，部分肾小管上皮细胞凝固性坏死、脱落，腔内可见管型，并可见间质水肿，间质内灶性炎症细胞浸润，肾小球病变不明显。而DAPT组的肾脏病理改变在各时点均较同期IRI组明显减轻。

2肾功能改变

在IRI 组，BUN、Scr于再灌注6 h即显著升高，且随着再灌注时间的延长呈现进行性升高，于24 h达高峰，之后逐渐下降，在各时点均显著高于sham组(P<0.05)；而在DAPT组，再灌注2 h时BUN、Scr水平与IRI 组相比无统计学差异，在其余各时点BUN、Scr水平则均明显低于IRI 组(P<0.05)，见表1。

表1　各组大鼠血清BUN、Scr、TNF-α和IL-6含量的变化

*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIRI group.

3血清TNF-α和IL-6含量的变化

在IRI 组，大鼠血清TNF-α和IL-6含量在各时间点均显著高于sham组(P<0.05)，且随着再灌注时间的延长呈现进行性升高；而在DAPT组，血清TNF-α、IL-6含量在各时点均显著低于IRI 组(P<0.05)，但在48 h前仍高于sham组(P<0.05)，在48 h后与sham组相比无统计学差异，见表1。

4肾组织Notch1、TLR4和NF-κB p65蛋白的表达

4.1免疫组化结果Notch1、TLR4和NF-κB p65主要表达于肾小管上皮细胞胞质中，在sham组表达较弱，而在IRI 组则有高表达，于再灌注6 h时点， 3者即有明显表达，于再灌注24 h表达最强，之后表达减弱。在DAPT组，3者在各时点的表达均较IRI组显著减弱，但仍较sham组为强，见图1～3。

Figure 1.The expression of Notch1 in the renal tissue of the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200). A: sham group; B: reperfusion for 6 h in IRI group; C: reperfusion for 6 h in DAPT group; D: reperfusion for 12 h in IRI group; E: reperfusion for 12 h in DAPT group; F: reperfusion for 24 h in IRI group; G: reperfusion for 24 h in DAPT group; H: reperfusion for 48 h in IRI group; I: reperfusion for 48 h in DAPT group; J: reperfusion for 72 h in IRI group; K: reperfusion for 72 h in DAPT group.

图1各组大鼠肾组织Notch1的表达

Figure 2.The expression of TLR4 in the renal tissue of the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200). A: sham group; B: reperfusion for 6 h in IRI group; C: reperfusion for 6 h in DAPT group; D: reperfusion for 12 h in IRI group; E: reperfusion for 12 h in DAPT group; F: reperfusion for 24 h in IRI group; G: reperfusion for 24 h in DAPT group; H: reperfusion for 48 h in IRI group; I: reperfusion for 48 h in DAPT group; J: reperfusion for 72 h in IRI group; K: reperfusion for 72 h in DAPT group.

图2各组大鼠肾组织TLR4的表达

Figure 3.The expression of NF-κB p65 in the renal tissue of the rats with different treatments (immunohistochemical staining, ×200). A: sham group; B: reperfusion for 6 h in IRI group; C: reperfusion for 6 h in DAPT group; D: reperfusion for 12 h in IRI group; E: reperfusion for 12 h in DAPT group; F: reperfusion for 24 h in IRI group; G: reperfusion for 24 h in DAPT group; H: reperfusion for 48 h in IRI group; I: reperfusion for 48 h in DAPT group; J: reperfusion for 72 h in IRI group; K: reperfusion for 72 h in DAPT group.

图3各组大鼠肾组织NF-κB p65的表达

4.2Western blot检测结果Notch1、TLR4和NF-κB p65在sham组大鼠肾组织表达较弱，而在IRI 组则有高表达，于再灌注6 h 三者即有明显表达，随着再灌注时间的延长其表达随之增强，于再灌注24 h达到峰值，在各时点的表达水平均显著高于sham组(P<0.05)。在DAPT组，三者的表达水平在各时点均较IRI组显著降低(P<0.05)，但仍高于sham组(P<0.05)，见图4。

讨论

肾IRI是急性肾损伤的主要发病机制之一，而炎症是肾IRI 的一个重要病理生理机制。缺血再灌注可引发炎性细胞聚集、炎性因子(如TNF-α、IL-1、IL-6)和化学趋化因子(如MCP-1)释放及黏附分子增加，它们共同作用激发炎症的级联反应，导致炎症的发生，进而引起器官损伤[2-4]。本实验观察到，IRI组大鼠呈现以急性肾小管间质损伤为主，伴有炎性细胞浸润的病理学特征，且随着再灌注时间延长肾脏病理改变愈发显著，同时出现BUN、Scr水平显著升高和血清炎性因子TNF-α、IL-6含量显著增加，并随着再灌注时间的延长呈现进行性升高。上述结果说明，缺血再灌注诱发了肾组织炎症反应的发生，并导致肾功能障碍。

近年来在对启动机体炎症反应的研究中，TLR4的作用备受瞩目。TLR4 作为“门户”蛋白启动机体的炎症链式反应，在跨膜信号转导受体家族TLRs中占有重要的位置。TLR4广泛存在于血管内皮细胞、单核(巨噬)细胞、中性粒细胞和树突状细胞等多种细胞中，其被生物配体(如脂多糖、高迁移率部族蛋白1、热休克蛋白等)识别及结合后，可激活细胞内的信号传导通路，促发下游通路NF-κB活化，诱导促炎细胞因子(如TNF-α、IL-1β 、IL-6等)的产生和释放，从而引起和促进组织的炎症损伤[6, 13]。

研究表明，肾IRI发生时可启动多种信号通路，其中具有高度保守性的Notch信号通路可被重新激活，参与肾小管上皮细胞的再生与修复[5]。Notch信号通路由一系列的蛋白分子家族组成，在哺乳动物中包括4种受体(Notch1～Notch4)和5种配体(DLL1、DLL3、DLL4、jagged1和jagged2)。受体和配体均为跨膜蛋白，分为胞内段和胞外段。Notch信号通路直接以相邻细胞件的受体与配体结合，然后启动信号传递，而不需要第二信使及蛋白激酶参与其中。受体与配体结合后，通过γ-分泌酶裂解，胞内段可转位至细胞核，启动相关靶基因转录[5,14]。Notch在成熟的器官组织中表达极低，但在组织损伤和应激情况下表达增加。已有研究报道Notch信号通路参与肾IRI时的炎症反应，但其与TLR4信号通路之间是否发生交互作用，从而调节TLR4诱导的炎症反应水平？目前鲜有文献报道。

Figure 4.The expression of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissue of the rats detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsIRI group.

图4Western blot检测各组大鼠肾组织Notch1、TLR4和NF-κB p65蛋白的表达

已有研究证明，脂多糖刺激巨噬细胞后可以同时引起TLR4高表达及DLL4/Notch1信号通路的活化，通过NF-κB通路，直接与TNF-α、iNOS共同介导炎症反应[11, 15]。本实验显示，在IRI组，随着再灌注时间的延长，肾脏病理显示间质中炎细胞浸润明显，血清TNF-α和IL-6含量升高，而肾组织中Notch1、TLR4及NF-κB p65表达明显增强，且Notch1表达与TLR4、NF-κB p65表达水平相平行，同时Notch1、TLR4及NF-κB p65蛋白表达的高峰时间与血清TNF-α、IL-6升高相一致，均于再灌注24 h达到高峰，之后逐渐减弱。结果提示，在肾IRI的早期，Notch信号通路被活化，并与TLR4、NF-κB p65同步参与了肾IRI的炎症反应。同时我们推测，在缺血再灌注过程中，组织损伤产生内源性配体与TLR4结合，通过激活下游NF-κB通路，促进炎性细胞因子分泌而介导炎症反应；组织的炎症损伤因子又可继续作为TLR4的内源性配体，形成正反馈机制，进一步扩大炎性损伤。而Notch信号通路可能通过NF-κB通路，与TLR4协同介导炎症反应。

有实验表明，用Notch的特异性配体，或者通过转基因纯合子的方法，上调肾小管Notch信号通路之后，可以加剧组织缺血再灌注损伤[16]。在体外和体内实验中，DAPT可以下调很多缺氧上调的炎症介质，减少巨噬细胞活化，同时也可以下调NF-κB p65的表达和易位，下调TLR4/MyD88通路，从而显示出Notch和NF-κB之间的交互作用[17-18]。Zeng等[11]在分离培养的人主动脉瓣间质细胞中，证明用Notch1受体的特异性配体Jagged1能增强TLR4介导的NF-κB的活化，DAPT能抑制TLR4介导的NF-κB的磷酸化，从而调控TLR4介导的炎症反应。

为探讨Notch参与肾脏IRI的炎症反应的机制，本实验采用γ-分泌酶抑制剂DAPT干预Notch信号通路，并观察其对TLR4/NF-κB炎症通路的影响。结果显示，DAPT组大鼠在再灌注6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时点肾功能均较IRI组明显改善，肾小管间质损伤和炎症细胞浸润明显减轻，血清炎性因子TNF-α、IL-6含量均显著降低，且高峰提前至12 h后逐渐下降；同时，使用DAPT干预后，肾组织中不仅Notch1表达较IRI组显著减弱，而且TLR4和NF-κB p65的表达也较IRI组同步减弱。这提示DAPT不仅抑制了Notch通路，而且还可能通过NF-κB通路与TLR4有交互作用，共同下调炎性因子的生成与释放，并阻断TLR4损伤的正反馈机制，阻抑或减轻TLR4所致的炎症反应，发挥肾保护作用。但肾脏IRI 的机制非常复杂，有多种信号通路和细胞因子参与其中，Notch通路与TLR4通路的交互作用机制仍需进一步研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Role of Notch pathway in Toll-like receptor 4 mediated inflammatory response in renal ischemia reperfusion injury in rats

XU Xiao-chang1, ZHU Ye1, ZHANG Hui-tao1, CHEN Ping-zhen1, ZHENG Jing1, JIA Ning1, LIN Yu-jing2, LI Ling-ling3, ZHANG Hua1

(1DepartmentofNephrology,2DepartmentofPathology,3CentreofLaboratory,TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Zhuhai519000,China.E-mail:zh3196@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To investigate the role of the Notch pathway in Toll-like receptor 4 (TLR4)-mediated inflammatory response in renal ischemia reperfusion injury (IRI) in rats. METHODS: A total of 75 male sprague-Dawley rats were randomly divided into sham operation group, IRI group and DAPT treatment group. Blood samples and the kidneys were obtained at 6 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h after reperfusion. The concentrations of blood urea nitrogen (BUN) and serum creatinine (Scr) were measured. The serum levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) were detected by ELISA, and the expression of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissues was assessed by immunohistochemistry and Western blot. RESULTS: The serum levels of BUN, Scr, TNF-α and IL-6 in IRI group were markedly increased as compared with sham group (P<0.05). The protein levels of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in renal tubular epithelial cells in IRI group was significantly enhanced as compared with sham group (P<0.05). In DAPT group, the serum levels of BUN, Scr, TNF-α and IL-6 were significantly reduced compared with IRI group (P<0.05), and the protein levels of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 were apparently less than those in IRI group (P<0.05). CONCLUSION: Significant changes of renal function, a rise of serum inflammatory factor including TNF-α and IL-6 and enhanced expression of Notch1, TLR4 and NF-κB p65 in the renal tissue occurred in the rats with IRI. γ-Secretase inhibitor DAPT attenuates TLR4-mediated inflammatory response in the renal IRI through the inhibition of Notch1 and down-regulation of NF-κB.

[KEY WORDS]Kidney; Ischemia-reperfusion injury; Notch pathway; Toll-like receptor 4; Inflammation

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.03.016

[中图分类号]R363.2+1

[文献标志码]A

通讯作者△Tel： 0756-2528189； E-mail: zh3196@126.com

*[基金项目]广东省自然科学基金资助项目(No.S2013010016698)；珠海市医学科研基金资助项目(No.201504)

[收稿日期]2015- 10- 08[修回日期] 2015- 12- 08

[文章编号]1000- 4718(2016)03- 0485- 07

杂志网址： http://www.cjpp.net