马齿苋对戊四氮致癫痫大鼠海马细胞凋亡和Caspase-3基因表达的影响①

孙维佳，吴庆峰，张晓梅

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003;2.齐齐哈尔医学院第一附属医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000)



马齿苋对戊四氮致癫痫大鼠海马细胞凋亡和Caspase-3基因表达的影响①

孙维佳1,2，吴庆峰1，张晓梅1

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯154003;2.齐齐哈尔医学院第一附属医院，黑龙江 齐齐哈尔 161000)

摘要：目的：探索马齿苋对戊四氮(PTZ)致痫大鼠海马神经元的保护作用。方法：应用戊四氮隔日腹腔注射制造癫痫慢点燃大鼠模型。将48只Wistar雄性大鼠分成4组：正常对照组、戊四氮组、低剂量马齿苋组、高剂量马齿苋组、，每组6只。采用WESTBLOT法检测Caspase-3检测大鼠海马组织内Caspers-3蛋白变化，流式细胞仪检测细胞凋亡数量变化。结果：PTZ组的神经元凋亡细胞和Caspase-3的表达明显增多，应用马齿笕的两组癫痫大鼠的神经细胞的凋亡受到了抑制，减少了Caspase-3的表达。结论：马齿苋有保护癫痫大鼠脑组织的作用，且长期大剂量的效果显著，为了给临床应用提供理论依据，本实验通过实验观察马齿苋对戊四氮致痫大鼠海马神经元的保护作用，探索马齿笕在改善癫痫方面的应用价值。

关键词：马齿苋；戊四氮；癫痫；细胞凋亡；Caspers-3

癫痫是慢性反复发作性短暂脑功能失调综合征，反复痫性发作表现为脑神经元异常放电，引起发作性意识丧失。癫痫持续状态可导致中枢神经系统急症及持久性损害，尤其对海马神经元损伤较大，根据流行病学检测，我国癫痫患者，一般人群的癫痫年发病率为50~70/10万，患病率约为5‰[1，2]。其中难治性癫痫的患者约占25%。传统治疗多为西药，副作用较大，而中药马齿苋为马齿苋科植物马齿苋的干燥地上部分。性寒，味酸，具有清热解毒、凉血止血的功效，现代对马齿苋的药理作用研究多集中在其抗炎、抗病毒作用方面。近年来随着研究的深入，对马齿苋的研究扩展到抗肿瘤、降血脂、增强免疫力、抗氧化等发面，并已经取得了一定的成果[3，4]。本实验应用PTZ致痫大鼠模型，给予中药马齿苋干预，研究马齿苋对PTZ致癫痫大鼠海马细胞凋亡和Caspers-3蛋白表达的影响，探求马齿苋对癫痫大鼠的神经元保护作用。

1材料与方法

1.1实验材料

①实验动物准备：健康Wistar雄性大鼠60只，8~10周龄，体重200~250g，购买与齐齐哈尔医学院动物实验中心。

②实验药物：马齿苋(购买于齐齐哈尔医学院第一附属医院药剂科并经鉴定，由安国市药兴药材有限公司饮片加工厂)使用下述方法制备成浓度分别为g/mL的水煎醇提液：(1)用10倍体积的蒸馏水中浸泡生药2h，(2)加热至沸腾后，再用小火煎1h，过滤后收集；(3)再加入10倍体积的蒸馏水，沸腾后小火煎1h，过滤后收集滤液。(4)重复步骤(3)；(5)混合(2)、(3)过滤液，再浓缩至浓度100%的中药液，过滤后收集；(6)使用磁力搅拌器边搅边加入3倍量无水乙醇，持续搅拌，放置24h；(7)过滤，用离心机2000rpm/min离心30min，吸取上清液；(8)上清液将无水乙醇全部挥发，从而制成浓度为g/mL的溶液；(9)高温高压灭菌，分装后放置4℃保温箱保存。计算实验动物给药剂量，按体重计算，成人马齿苋1日剂量为80g(人的标准体重按60kg算)，鼠的一日等效剂量约为6.25×人的1日剂量，低、高剂量分别是等效剂量的0.5、2倍，如上述方法计算出大鼠的马齿苋给药低、高剂量分别3.50g/kg·d、13.93g/kg·d，而制成水煎剂浓度分别为 40%、160%，无菌分装4℃保存备用。

③制作动物模型：将大鼠随机分为5组，每组10只。空白组：隔日腹腔注射生理盐水 3.5mL/kg, 共13次。PTZ组：隔日腹腔注射35mg/kg戊四氮，共13次，每日提前30min给予0.9%生理盐水3.5mL/kg腹腔注射。

低剂量马齿苋组：除隔日腹腔注射戊四氮外，且每日提前30min给予马齿苋3.50g/kg·d腹腔注射。

高剂量马齿苋组：除隔日腹腔注射戊四氮外，每日提前30min给予马齿苋13.93g/kg·d腹腔注射。

④癫痫级别评价：按Racine分级方法分为5级观察大鼠行为变化：0级：无惊厥；Ⅰ级：面肌痉挛，如同湿狗似抖动，Ⅱ级：面、颈部痉挛，表现为点头扭头等；Ⅲ级：一侧前肢阵挛，面部痉挛及节律性点头；Ⅳ级：面部、颈部痉挛、双侧前肢阵挛伴后肢站立；Ⅴ级：全身阵挛失去平衡跌倒、面部痉挛、节律性点头、前肢阵挛、后肢站立。戊四氮药物注射后各组大鼠逐渐出现癫痫症状，最初呈Ⅱ级发作，且时间短，为癫痫潜伏期。注射结束后到出现Ⅴ级发作时间的癫痫大发作持续时间为1h，出现Ⅴ级大发作，慢点燃模型制备成功，实验过程中戊四氮组大鼠死亡3只,低剂量马齿苋组死亡1只。

1.2方法

①标本取材：动物药物注射实验全部结束24h后，给与10%水合氯醛按体重腹腔注射麻醉，断头处死大鼠，取脑组织，在低温冰块上分离出双侧海马组织，取大鼠右侧海马组织PBS液冲洗，分离，流式细胞仪测定凋亡细胞。大鼠左侧海马组织剪碎，按7倍体积加入总蛋白提取液，如样本40mg配制280μL蛋白提取液。组织使用超声匀浆粉碎，在4℃下放置1h，使用12000rpm 离心30min，吸取上清液，用BCA试剂盒检测标本的蛋白浓度，分装后用-80℃冻存，备用。

② 流式细胞仪检测凋亡细胞：大鼠右侧海马组织细胞离心沉淀3~5min，加入PBS液，离心沉淀细胞；稀释；调节其浓度；将细胞悬液加入PI溶液；混匀后孵育15min，在反应管中加入PBS液，流式细胞仪(FACS)测定凋亡细胞。

③ WESTBLOT法检测caspase-3：制备不连续SDS-PAGE。取各组总蛋白40μg，蛋白样品中加入SDS-PAGE，煮沸7min，使蛋白变性，冷却后，跑胶。准备转膜，漂洗蛋白膜2min，4℃封闭过夜，4℃孵育过夜，用TPBS液洗膜5次，每次5min，同时加入羊抗免 IgG 荧光抗体和羊抗鼠 IgG 荧光抗体( 1：3000，封闭液稀释)，37℃孵育1h，TPBS 洗膜4次，每次 5min，PBS液洗膜5min。Odyssey远红外荧光扫描成像系统扫描，后测定目标带单位密度，Caspers-3的相对密度用β-actin做为参照。

1.3统计学方法

采用SPSS13.0进行处理，P<0.05认为有统计学意义。

2结果

2.1凋亡细胞率

空白组脑组织海马区的细胞凋亡率最低，仅可见到的少量凋亡细胞，0.093±0.007，PTZ组凋亡细胞率最高为0.435±0.033，PTZ组+低马齿苋组凋亡细胞率为0.227±0.02。PTZ+高马齿苋组凋亡细胞率为0.165±0.014，各组间区域比较经过t检验(P<0.05)。见表1。

表1　凋亡阳性细胞计数凋亡率 ±s)

各组间区域比较经过t检验，为差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2Caspase-3蛋白表达

Caspase-3蛋白：空白组0.28±0.02；PTZ=0.54±0.03；低马齿苋组0.35±0.03; 高马齿苋组0.30±0.01。PTZ癫痫组大鼠与正常空白对照组相比，Caspase-3蛋白水平明显升高(P<0.05)；马齿苋干预后可显著降低Caspase-3蛋白水平(P<0.05)；低马齿苋组及高马齿苋组无明显统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2　Caspse-3定量检测比较

各组间区域比较经过t检验，为差异具有统计学意义(P<0.05)。

3讨论

全世界约有五千万的癫痫患者，患者数量众多，癫痫病是一种以反复痫性发作为特征的慢性疾病[5]，癫痫的药物治疗一旦开始服药，大多数要长期用药，直到癫痫得以控制，如患者及家属随意停用药物或减量，可能导致病情加重，甚至出现持续癫痫状态，然而癫痫药物的不良反应也应重视，服用一些治疗癫痫的西药例如卡马西平、苯巴比妥、托吡酯等药物会出现肝肾损伤，行为异常、周围神经损害、情绪等异常，认知功能受损；眩晕嗜睡、感觉异常、皮疹等等，中药马齿苋副作用小、价格低廉、采集方便等优点，药理作用研究多在抗病毒、抗炎、抗肿瘤、降血脂、增强免疫力抗氧化等[6，7]，但对癫痫治疗，脑保护未见研究，本实验研究结果发现，PTZ组的神经元凋亡细胞和Caspase-3的表达明显增多，而应用马齿苋干预后的两组癫痫大鼠的神经细胞的凋亡受到了抑制，减少了Caspase-3的表达，并且高剂量的马齿苋效果更好，从而证明了马齿苋可以治疗癫痫，减少脑组织损伤的机制与抗神经元细胞凋亡有关，其抗凋亡的机制是通过对Caspase-3蛋白基因的调控来表达实现的，但这种调控的分子机制及其是否有其它调控机制还需要下一步的研究，本实验为寻求难治性癫痫提供新途径。

参考文献：

[1]Coulter DA, Mclntyre DC, Loscher W. Animal models of limbi epilepsies:what can they tell us[J].Brain Pathol, 2002, 12: 240-256

[2]LoscherW. Animal models of intractable epilepsy[J].Prog Neurobiol, 1997,53:239-258

[3]Bmnghton B R，Reutens D C，Sobey C G. A poptotie mechanism s after cerebral isehemia[J].Strob, 2009, 40 (5):331-339

[4]MoroniF. Poly (ADP-ribose) polym erase 1(PARP=1) and postischem ic brain darnage[J].Curr0pin Pharmacol, 2008, 8(1):96-103

[5]栾倩,刘蕾,刘君星.灵芝酸对痫样放电海马神经元ERK1/2磷酸化水平的影响[J].黑龙江医药科学，2014，37(2):1-3

[6]王影，聂磊，张岩，等.左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能及海马组织中NPY和NCAM-mRNA表达的影响[J].黑龙江医药科学，2013，36(3)：3-5

[7]张岩，王海燕.左乙拉西坦对癫痫大鼠认知功能的影响研究[J].黑龙江医药科学， 2013，36(2)：6-8

(收稿日期：2015-01-10)

中图分类号：R742.1

文献标识码：A

文章编号：1008-0104(2016)01-0053-02

作者简介：孙维佳(1981～)女，黑龙江五大连池人，在读硕士研究生，主治医师。通讯作者：张晓梅(1969～)女，黑龙江佳木斯人，硕士，主任医师，教授,硕士研究生导师。E-mail:sjkx2727@163.com。

基金项目：黑龙江省教育厅科研项目，编号：12521543。