狗獾东北亚种雌性生殖系统的组织学研究

王素， 葛艳艳， 刘玉堂*

(1. 东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨150040； 2. 庄河市第五高级中学，辽宁大连116413)

狗獾东北亚种雌性生殖系统的组织学研究

王素1， 葛艳艳2， 刘玉堂1*

(1. 东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨150040； 2. 庄河市第五高级中学，辽宁大连116413)

应用光镜对2011年4月和2012年6月、12月3个时期狗獾东北亚种Melesmelesamurensis的卵巢、输卵管、子宫、阴道进行观察。结果表明狗獾东北亚种各时期卵巢中均分布着不同发育阶段的卵泡、闭锁卵泡、黄体和基质；12月的卵巢中第Ⅰ、Ⅱ阶段卵泡数量较多，而第Ⅲ、Ⅳ阶段相对较少，4月、6月卵巢中第Ⅲ、Ⅳ阶段卵泡数量相对较多；卵巢基质中的间质腺极为发达。输卵管黏膜层形成多级皱褶且4月、6月较12月的发达；12月、4月及6月3个时期子宫内膜中均具有丰富的子宫腺且子宫腺的数目无明显差异。4月、6月阴道的黏膜上皮表现出不同程度的角质化，而12月的未见角质化。狗獾东北亚种雌性生殖系统呈现全年性发育活跃状态，明显不同于其他野生哺乳动物休情期呈现的周期性萎缩现象，这与其特殊的生殖生理特征相吻合。

狗獾东北亚种；生殖系统；组织学；繁殖周期

狗獾Melesmeles隶属于食肉目Carnivora鼬科Mustelidae，是鼬科中既具备延迟着床特性又具有半冬眠特性的动物。关于狗獾的繁殖周期，目前尚没有公认的结论，《中国动物志》记载狗獾的交配期为9—10月(高耀亭，1987)，但有人认为7—8月为其发情交配期(韩庆，彭友林，2002；游树楷，2002)，也有人认为狗獾的发情配种期主要在3月末—6月，胚胎滞育期为5～11个月，产仔集中在3—4月(Yamaguchietal.，2006；刘玉堂，陈忠，2010；王亮等，2015)。本研究试图通过观察雌性狗獾卵巢、输卵管、子宫、阴道在不同时期的组织学变化特征，揭示狗獾特殊的繁殖周期及生殖生理机制，为提高圈养狗獾的繁殖率提供基础资料。

1 材料与方法

分别于2011年12月和2012年4月、6月在黑龙江省双鸭山市饶河脉动珍稀动物繁育有限公司饲养场取2年以上健康成年雌性狗獾东北亚种M.m.amurensis各3只。采用常规解剖学方法取出生殖系统，将其分别固定于10%福尔马林溶液中，经石蜡切片，苏木精-伊红(HE)染色，制成永久切片。光镜下观察并拍照，显微测微尺测量，实验中与直径、厚度、高度相关的测量均为不同方向上的测量值求取的平均值，横切面积的测量是选择不同位置的子宫腺，测量其长、宽后计算面积，再将计算得到的面积取平均值。所有数据用Excel和SPSS 18进行统计分析。

2 结果

2.1 卵巢的组织结构

卵巢组织结构包括生殖上皮、白膜、皮质和髓质。生殖上皮覆盖于卵巢表面，为单层立方形细胞。白膜位于生殖上皮之下，由致密结缔组织构成。皮质中分布了大量的间质腺、不同发育阶段的卵泡、闭锁卵泡、黄体和基质(图版I：A)。根据卵泡发育的不同程度分为第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ阶段：第Ⅰ阶段为原始卵泡，第Ⅱ、Ⅲ阶段为腔前卵泡，第Ⅳ阶段为有腔卵泡。皮质浅层以第Ⅰ、Ⅱ阶段卵泡多见，第Ⅲ、Ⅳ阶段卵泡主要分布于皮质深层。髓质位于皮质内侧，较小，为疏松结缔组织。

2.1.1 不同发育阶段卵泡的组织结构(表1) 第Ⅰ阶段：卵泡细胞较小，数量多。由单层扁平颗粒细胞围绕。单个或三五成群聚在一起或形成1串分布于皮质的浅层(图版Ⅰ：A)。

第Ⅱ阶段：卵母细胞开始增大，颗粒细胞开始由扁平状向立方状转变。颗粒细胞与卵母细胞之间出现裂隙。卵泡细胞外包有1层基膜，但不明显。

第Ⅲ阶段：卵母细胞体积显著增大，由2至数层颗粒细胞围绕。当出现1～2层颗粒细胞时，形成完整的透明带。卵泡膜逐渐变得清晰，为连续的扁平细胞并形成多层，与成纤维细胞相似。在数据统计时，将其中单层立方状颗粒细胞围绕的卵泡定为A期，2至数层细胞围绕的卵泡为B期。

第Ⅳ阶段：卵母细胞透明带增厚，由多层颗粒细胞围绕，卵泡膜增厚，在内层出现血管样结构并分化出一些上皮样内膜细胞。出现大的卵泡腔，卵母细胞逐渐移向卵泡的一侧，形成卵丘。卵母细胞圆而大，细胞核明显。颗粒细胞形成典型的放射冠结构(图版Ⅰ：B)。在数据统计时，卵泡可分为C期(相当于三级卵泡)和D期(相当于成熟卵泡)。

皮质中的各阶段卵泡数量和发育程度与取材的季节具有一定的相关性。12月卵巢中第Ⅰ、Ⅱ阶段卵泡数量相对较多，而第Ⅲ、Ⅳ阶段卵泡数量相对较少，4月、6月卵巢中第Ⅲ、Ⅳ阶段卵泡数量明显增多。

2.1.2 闭锁卵泡的组织结构 闭锁卵泡可见于各个时期，但多见于有腔卵泡。不同时期的闭锁卵泡在形态上有差异。第Ⅰ阶段的闭锁卵泡很少见，主要表现为卵泡及卵母细胞的形状不规则，卵母细胞固缩变形，卵泡细胞排列不整齐。第Ⅱ阶段和第Ⅲ阶段的闭锁卵泡主要表现为卵母细胞皱缩变形，细胞核固缩变形，透明带塌陷，颗粒细胞层松散、基膜消失。有腔卵泡的闭锁是一个连续的过程，可分为3个阶段：早期，颗粒细胞分布不均匀，部分排列松散，开始退化和萎缩；中期，基膜消失，卵母细胞出现异常，卵泡腔变形，不均匀的颗粒细胞层变薄且有的颗粒细胞脱落进入卵泡腔中，颗粒细胞核明显固缩，卵泡内膜上皮细胞开始增殖、扩散；后期，卵母细胞消失，卵泡腔明显缩小，颗粒细胞完全消失，被上皮样细胞所取代(图版Ⅰ：C)，卵泡内膜增厚，透明带塌陷变形，最后形成了似白体的组织。

2.1.3 黄体的组织结构 黄体外周包有1层与原始卵泡外膜相似的致密结缔组织被膜，可伸入黄体实质内形成少量间质。黄体细胞分为2种：一类是大黄体细胞，细胞大呈多边形，细胞核为圆形或椭圆形，数量较多；另一类是小黄体细胞，细胞梭形，核也为梭形，多成群分布于大黄体细胞间。6月卵巢中的黄体数量较12月、4月的多，6月黄体组织中小黄体细胞数量较多，4月、6月黄体中血管较12月的丰富。12月、4月和6月黄体的平均直径差异无统计学意义(P>0.05)(表2，图版Ⅰ：D)。

2.1.4 卵巢基质中间质腺的组织结构 狗獾的间质腺较发达，大量的间质腺细胞散布在卵巢的基质中，被结缔组织和血管分隔，呈现出大小不一、分散的细胞群。间质腺细胞形状不规则，呈多边形，细胞核圆而大(图版Ⅰ：D)。

2.2 输卵管的组织结构

输卵管从外到内为浆膜、肌层和黏膜。浆膜由疏松结缔组织和间皮组成。肌层为内环外纵，厚115.64～248.00 μm，其间具明显的血管。黏膜上皮为单层立方上皮，固有膜为疏松结缔组织，内含成纤维细胞、毛细血管、平滑肌细胞。黏膜层向内形成若干初级皱褶(图版Ⅰ：E)，有的皱褶可分化出2～3级次级皱褶。4月、6月黏膜层形成较多的次级皱褶，固有膜中的腺体多而饱满，腔内有分泌物，而12月腺体较少，腔内未见分泌物，次级皱褶较少。

图版Ⅰ 4月、6月和12月狗獾东北亚种雌性生殖系统 Plate Ⅰ Reproductive system of female Meles meles amurensis in April， June and December (×400)

A. 4月卵巢皮质，可见原始卵泡(×400); B. 4月卵巢皮质，可见有腔卵泡(×400); C. 6月卵巢皮质，可见闭锁卵泡(×400); D. 4月卵巢皮质， CL. 黄体细胞， IG. 间质腺细胞(×400); E. 4月输卵管粘膜，可见多级皱褶(×100); F. 12月子宫角，可见发达子宫腺(×400); G. 6月子宫，可见发达子宫腺(×100); H. 12月阴道黏膜(×400); I. 4月阴道黏膜(×400)。

A. Ovarian cortex in April， primordial follicles can be seen(×400); B. Ovarian cortex in April， antrap follicle can be seen(×400); C. Ovarian cortex in June， atretic follicle can be seen(×400); D. Ovarian cortexin in April， CL. corpus luteum， IG. interstitial gland (×400); E. Tubal mucosa in April， multistage ruffles can be seen(×100); F. Uterine horn in December， developed uterine gland can be seen(×400); G. Uterus in June， developed uterine gland can be seen(×100); H. Vaginal mucosa in December (×400); I. Vaginal mucosa in April (×400).

表1 狗獾东北亚种各阶段卵母细胞核直径、卵母细胞直径、卵泡直径、透明带厚度Table 1 Diameter of oocytes nucleus， oocytes， follicle and the thickness of the transparent tape of Meles meles amurensis in different stages

2.3 子宫的组织结构

子宫从外到内为浆膜、肌层和内膜。浆膜由疏松结缔组织和间皮构成，肌层内环外纵，内膜各部位略有不同。

子宫角内膜上皮为单层柱状细胞或单层立方形细胞，散布在整个固有层中，内膜向子宫腔内形成纵行的皱壁状突起。靠近内膜上皮的子宫腺较大，腺体细胞为高柱状，腺腔中可见粉色分泌物(图版Ⅰ：F，G)。位于深层的子宫腺则相对较小，腺腔内无分泌物。

表2 12月、4月、6月狗獾东北亚种黄体的平均直径和最大直径Table 2 The average and the maximum diameter of corpus luteum in Meles meles amurensis in December， April and June

子宫体内膜上皮为单层柱状细胞，子宫腺丰富但比子宫角中的少。狗獾子宫角、子宫体中腺体细胞高度、数量和模切面平均值的相关统计见表3。内膜向子宫腔内形成纵行的皱襞状突起。腺体细胞为单层柱状，腺腔中有粉色分泌物，有的子宫腺开口直接与内膜上皮相延续。位于深层的子宫腺相对较小，为单层柱状细胞，腺腔内无分泌物。

子宫颈内膜上皮为2层立方细胞，内膜向子宫腔内形成纵行的皱壁，固有膜中无腺体。

表3 狗獾东北亚种子宫角、子宫体中腺体细胞高度、数量和横切面平均值Table 3 The average height, number and cross sectional area of uterine gland in the uterine body and horns of Meles meles amurensis

2.4 阴道的组织结构

阴道从外到内分别为浆膜、肌层和黏膜。浆膜由疏松结缔组织和间皮构成。肌层中环形肌层发达，被结缔组织分成束状。黏膜上皮为复层扁平细胞，更深一层细胞为矮柱状。4月、6月狗獾的黏膜上皮表层细胞角质化，呈鳞片状(图版Ⅰ：I)，而12月的未角质化(图版Ⅰ：H)。固有膜中有许多血管和不规则致密结缔组织，不含有腺体。

3 讨论

3.1 狗獾卵巢及卵泡发育过程的组织结构特征

在卵泡腔出现之前，卵母细胞和卵泡的直径同步增加，为同步发育阶段；卵泡腔出现后，卵母细胞直径和体积增加较慢，而卵泡直径和体积增长较快，为不同步发育阶段。这与水貂Mustlavison(刘玉堂等，1995)、蓝狐Alopexlagopus(Cuietal.，2012)、大熊猫Ailuropodamelanoleuca(冯文和等，1996)、小熊猫Ailurusfulgens(修云芳，2010)等哺乳动物相似。12月、4月和6月中不同发育时期的卵泡数量变化表明卵巢中卵泡生长呈波浪式。

12月、4月、6月3个时期的卵巢中均存在第Ⅳ阶段卵泡。而12月狗獾处于冬眠时期，其卵巢应处于静止状态，但实验观察却并非如此。该现象与水貂、蓝狐等野生动物在12月卵巢极度萎缩、处于静止状态明显不同。这可能与狗獾特殊的繁殖机能或超长的延迟着床有关，有待进一步研究。

3.2 狗獾卵巢中的黄体特征

狗獾卵巢黄体主要由大、小黄体细胞构成，这与小熊猫(修云芳，2010)、双峰驼Camelusbactrianus(陈秋生，刘宗平，2002)、小尾寒羊Ovisaries(毛文智等，2011)等相似，而水貂卵巢中新形成的黄体中有3种细胞：梭形细胞、长条形细胞和多面体形细胞(刘玉堂等，1995)。本次实验在狗獾黄体中未发现长条形的黄体细胞。

12月、4月、6月的狗獾卵巢中均存在黄体，其功能是分泌雌激素、孕酮等(Devoto & Fuentes，2009)。孕激素是妊娠建立和维持必不可少的甾体激素(Szekeresetal.，2008)。陈静波(2003)在研究牛妊娠期黄体形态结构时发现，随着妊娠期的推迟，大黄体细胞和小黄体细胞的形态和数量都有所改变。在研究貂延迟着床时发现，貂在排卵后黄体退化，孕酮分泌量极少，随即便进入延迟着床(Enders，1952)。狗獾延迟着床时间远长于水貂(Mead，1981;王亮等，2015)，狗獾卵巢中黄体分泌的孕酮如何影响胚胎着床的作用机制有待进一步研究。

3.3 狗獾卵巢中的间质腺

狗獾卵巢中的间质腺较发达，间质腺被认为能够分泌雌激素(高茂英，2001)。雌激素与孕酮的组合是调控胚胎着床的主要激素(Lizetal.，2009；雷伟，杨增明，2010)。对小鼠、大鼠等啮齿类动物的研究发现，注射少量雌激素可以使处于延迟着床时期的胚泡迅速发生着床，表明卵巢雌激素对于啮齿类胚胎植入的启动是必须的(Whitten，1958)。狗獾胚胎滞育时间一般为5～11个月(Yamaguchietal.，2006；刘玉堂，陈忠，2010)，期间子宫发育良好，支持胚胎存活却又能避免胚胎着床，一直坚持到固定时间窗口——1月中旬左右才启动胚胎着床。在胚胎着床晚期一般不形成卵泡，而雌激素主要是在卵泡发育过程中形成的，那么狗獾发达的间质腺所分泌的雌激素可能在滞育期胚胎的着床启动中起重要作用。

3.4 狗獾输卵管、子宫、阴道的组织结构变化

不同时期狗獾的输卵管无明显变化。子宫腺的分泌物可供给附植前期胚胎营养。12月、4月及6月子宫角中丰富的子宫腺可能为狗獾延迟着床期的胚胎提供一定的营养，为胚胎的附植做准备。蓝狐非发情期子宫角中的子宫腺是明显减少的(刘玉堂等，1993)。狗獾东北亚种4月、6月为发情交配期，12月为冬眠期，而12月、4月、6月3个时期狗獾的子宫角中子宫腺的数目无明显差异，可能与狗獾特殊的繁殖机能或超长的延迟着床时间有关。

哺乳动物阴道黏膜上皮形态变化与其繁殖行为相吻合，例如蓝狐发情期阴道上皮出现角质化，而非发情期黏膜上皮则较薄，未角质化(刘玉堂等，1993)。本研究中4月和6月狗獾阴道黏膜上皮具有不同程度的角质化，这与4月、6月狗獾处于发情交配期相一致。而12月非发情交配期阴道上皮未见角质化。

3.5 狗獾生殖系统结构的周期变化

对狗獾生殖系统组织学观察表明，4月、6月的生殖系统均处于发育旺盛时期，12月的卵巢可见第Ⅳ阶段卵泡及黄体，间质腺发达，输卵管发育良好，黏膜层形成次级皱褶，子宫结构发育与4月、6月相似，子宫腺丰富，但阴道的黏膜上皮未见角质化。这表明狗獾在12月除阴道外，其他生殖器官仍然处于繁殖活动期。众所周知，季节性发情动物在繁殖期生殖系统发达，而在非繁殖期生殖系统萎缩，这是动物节约能量的进化稳定策略。而狗獾12月的生殖系统组织学特征表明其处于活动状态，这与12月狗獾胚胎处于延迟着床期，因此其卵巢需要保持卵泡及黄体发育以便分泌支持胚胎妊娠所需雌激素及孕酮有关。Yamaguchi等(2006)认为欧洲狗獾在生理上属于全年均可进行繁殖交配的动物，这与我们的研究结果相似。然而我们并未观察到狗獾东北亚种在8—12月有交配行为，这与其报道有所不同。这也许是狗獾东北亚种所独有的繁殖学特征，其意义是为了在8—12月有充分的时间获取食物、提高体脂含量以适应东北的寒冷，顺利度过冬眠而将繁殖交配集中在食物匮乏的4—6月。关于与其他报道中狗獾发情交配时间的差异可能是因为亚种间的差别，也可能是因为狗獾为夜行性动物而不易观察所导致(王亮等，2015)。本研究对于进一步确定狗獾的繁殖周期，以及指导狗獾人工繁育的生产实践具有重要意义。

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Hematologic Study on Reproductive System of FemaleMelesmelesamurensis

WANG Su1， GE Yanyan2， LIU Yutang1*

(1.College of Wildlife Resources， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;2. Zhuanghe Fifth Senior High School， Dalian， Liaoning Province 116413， China)

The ovaries， fallopian tubes， uterus and vagina of female bager (Melesmelesamurensis) were observed by light microscope in April， 2011， June and December， 2012. The results showed that there were different development stages of follicles， atretic follicle， corpus luteum and matrix in ovary in April， June and December. The amount of follicles in stage Ⅰ and Ⅱ of the ovary in December was larger than that in stage Ⅲ and Ⅳ. However， in April and June， the stage Ⅲ and Ⅳ had a larger amount of follicles in ovary. Interstitial gland in the matrix of ovary was highly developed. There was multi-stage ruffle in tubal mucosa and the ruffle was more-developed in April and June than in December. There was rich uterus gland in endometrium and no significant difference was found among the number of uterus gland in April， June and December. In April and June， the mucosa of vagina showed different degrees of keratinization. Histological analysis of reproductive system suggested that the sexual development of femaleM.melesamurensisstayed active throughout the year， which was entirely different from other wild mammals with the cyclical contraction in anestrus but consistent with its special reproductive physiological characteristics.

Melesmelesamurensis; reproductive system; histology; reproductive cycle

2016-02-28 接受日期：2016-04-13

国家林业局野生动植物保护司项目(林计发2015)； 东北林业大学大学生创新训练项目

王素(1995—)， 女， 本科生， 主要从事野生动物与自然保护区管理研究， E-mail:342005569@qq.com

*通信作者Corresponding author， E-mail:liu-yutang@foxmail.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160041

Q959.8

A

1000-7083(2016)04-0574-05