清热疏肝颗粒的质量标准研究

孙冬梅，陈秋谷，李养学，李素梅

(1.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095； 2.广州中医药大学，广东 广州 510405；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)



清热疏肝颗粒的质量标准研究

孙冬梅1，2，3，陈秋谷2，李养学1，3，李素梅1，3

(1.广东省中医药工程技术研究院，广东 广州 510095； 2.广州中医药大学，广东 广州 510405；3.广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095)

目的 建立清热疏肝颗粒的质量控制方法。方法 采用薄层色谱(TLC)法对清热疏肝颗粒中的黄芩、柴胡、连翘、鱼腥草进行定性鉴别；采用高效液相色谱(HPLC)法测定方中黄芩苷的质量分数。结果 薄层色谱(TLC)法所得斑点清晰、分离效果好，且阴性对照无干扰；黄芩苷在0.114～0.684 μg范围内与峰面积呈良好线性关系，r=0.999 9 ，平均回收率为97.33%，RSD=0.87%(n=3) 。结论 所建立的方法简便精确、重复性良好、专属性强，可用于清热疏肝颗粒的鉴别、质量评价与控制。

清热疏肝颗粒； 质量标准； TLC法； HPLC法； 黄芩苷

清热疏肝颗粒是广东省第二中医院的中药成方制剂，由黄芩、连翘、柴胡、鱼腥草、板蓝根、薄荷、生姜、金银花、甘草9味中药组成，具有清热解毒、疏肝散结的功效，临床上主要用于治疗感冒发热、肺热咳嗽等症。该方为中医临床经典验方，其疗效显著，被广大患者所接受。为了更好地控制其质量、保证临床疗效，本研究采用薄层色谱法对方中黄芩、柴胡、连翘、鱼腥草进行了定性鉴别，并采用高效液相色谱法对方中君药黄芩的有效成分黄芩苷进行质量分数测定，所建立的方法简便、准确、稳定且无干扰，可作为清热疏肝颗粒的质量控制方法[1]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

CAMAG TLC Visualizer薄层色谱数码成像系统(瑞士CAMAG公司)；Camag automatic tlc sampler4全自动点样仪(瑞士CAMAG公司)；Mettler xs205du电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；ELECTRONIC BALANLE电子天平(上海上天精密仪器有限公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；ZF-6050真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；939型薄层制板器(重庆市两岸贝尔德仪器技术厂)；Milli-Q Advantagc A10超纯水系统(美国默克密理博公司)；KQ-700DE数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；HWS-26电热恒温水浴锅(上海金坛市科析仪器有限公司)；DHG-9203A电热恒温鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)。

1.2 试药

黄芩苷对照品(批号：110715-200212)、黄芩药材(批号：120995-201309)、柴胡药材(批号：120992-201108)、连翘药材(批号：120908-201216)、鱼腥草药材(批号：121046-201105)均购自中国食品药品检定研究院；清热疏肝颗粒(批号：20150404、20150405、20150406)由广东省第二中医院制剂室提供。

甲醇、H3PO4为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱的鉴别

2.1.1 黄芩的薄层鉴别[2]取清热疏肝颗粒1.0 g，研细，加乙酸乙酯-甲醇(体积比3∶1)20 mL，超声处理(功率700 W，频率100 kHz)30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩对照药材0.25 g，加乙酸乙酯-甲醇(体积比3∶1)20 mL，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例制备缺黄芩的阴性对照样品 1.0 g，同法制得缺黄芩的阴性对照溶液。按照薄层色谱法(2015年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(体积比10∶3∶1∶2)为展开剂，预饱和30 min，展开，取出，晾干，喷以5%(质量浓度)三氯化铁乙醇溶液。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且阴性对照无干扰，结果见图1。

1 2 3 4 5

1.黄芩对照药材溶液； 2～4.供试品溶液； 5.缺黄芩阴性对照溶液。

图1 黄芩鉴别的TLC色谱图
Figure 1 TLC chromatogram of Radix Scutellariae

2.1.2 柴胡的薄层鉴别[3]取清热疏肝颗粒2.0 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解。用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，分别用水和氨试液洗涤2次，弃去水液和氨试液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例制备的缺柴胡阴性对照样品2.0 g，同法制得缺柴胡的阴性对照溶液。按照薄层色谱法(2015年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-乙酸乙酯-氨试液(体积比4∶1∶5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%(质量浓度)对二甲氨基苯甲醛的40%(体积分数)硫酸溶液，60 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰，结果见图2。

1 2 3 4 5

1.柴胡对照药材溶液； 2～4.供试品溶液； 5.缺柴胡阴性对照溶液。

图2 柴胡鉴别的TLC色谱图
Figure 2 TLC chromatogram of Radix Bupleuri

2.1.3 连翘的薄层鉴别[4]取清热疏肝颗粒2.0 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20 mL使溶解，用稀HCl调节pH值至2～3，用乙醚振摇提取3次，每次20 mL，弃去乙醚液，再用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取连翘对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例制备的连翘阴性对照样品2 g，同法制得缺连翘阴性对照溶液。按照薄层色谱法(2015年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10 μL，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-丙酮(体积比6∶4)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%(质量浓度)对二甲氨基苯甲醛的40%(体积分数)硫酸溶液，60 ℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰，结果见图3。

1 2 3 4 5

1.连翘对照药材溶液； 2～4.供试品溶液； 5.缺连翘阴性对照溶液。

图3 连翘鉴别的TLC色谱图
Figure 3 TLC chromatogram of Fructus Forsythiae

2.1.4 鱼腥草的薄层鉴别[5]取清热疏肝颗粒2.0 g，研细，加甲醇30 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL使溶解，加氨试液调pH至11～12，用三氯甲烷振摇提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取鱼腥草对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。再取按处方比例制备的缺鱼腥草阴性对照样品2.0 g，同法制得缺鱼腥草的阴性对照溶液。按照薄层色谱法(2015年版《中国药典》四部通则0502)试验，吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-甲酸乙酯-甲酸-水(体积比20∶10∶10∶1)的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，有相同颜色的荧光斑点，且阴性无干扰，结果见图4。

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1.鱼腥草对照药材溶液； 2～4.供试品溶液； 5.缺鱼腥草阴性对照溶液。

图4 鱼腥草鉴别的TLC色谱图
Figure 4 TLC chromatogram of Herba Houttuyniae

2.2 黄芩苷的测定[6-11]

2.2.1 对照品溶液的制备 取在60 ℃减压干燥4 h的黄芩苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含黄芩苷114 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取清热疏肝颗粒粉末0.2 g，精密称定，置100 mL容量瓶中，加入70%(体积分数，下同)乙醇适量，超声处理(功率700 W，频率100 kHz)30 min，取出，放冷，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺黄芩的阴性对照样品约0.2 g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.2.4 色谱条件 色谱柱：Aglient ZOKBAX SB-C18柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.2%(体积分数)H3PO4(体积比47∶53)；流速：1 mL/min； 柱温：25 ℃； 检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

2.2.5 专属性试验 分别精密吸取黄芩苷对照品、供试品、缺黄芩阴性对照溶液10 μL，分别按“2.2.4”项下色谱条件进行测定。结果显示，供试品溶液在与黄芩苷对照品溶液相应保留时间处有相同的色谱峰对应，缺黄芩阴性对照溶液无干扰，结果见图5。

2.2.6 线性关系的考察 分别精密吸取黄芩苷对照品溶液(质量浓度114 μg/mL)1、2、3、4、5、6 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为11.4、22.8、34.2、45.6、57.0、68.4 μg/mL的对照品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件依次进样10 μL，测定峰面积。以进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=3.034 6×103X-0.694 4，r=0.999 9(n=6)。结果表明黄芩苷在0.114～0.684 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

40302010040302010040302010005101520253011ABCt/minmAUmAUmAU

1.黄芩苷。A.黄芩苷对照品溶液； B.供试品溶液； C.缺黄芩阴性对照溶液。

图5 清热疏肝颗粒的HPLC 色谱图
Figure 5 HPLC of Qingre Shugan granules

2.2.7 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(批号：20150404)10 μL，按“2.2.4”项下色谱条件重复进样6次，测定黄芩苷峰面积。结果黄芩苷峰面积的RSD为0.16%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验 分别精密吸取同一供试品溶液(批号：20150404)10 μL，分别于制备0、2、4、8、10、12 h进样，按“2.2.4”项下色谱条件测定峰面积。结果黄芩苷峰面积的RSD值为0.22%(n=7)，表明供试品溶液在 12 h 内稳定性良好。

2.2.9 重复性试验 取同一批清热疏肝颗粒(批号：20150404) 6 份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件进行测定。结果黄芩苷平均质量分数为 21.465 5 mg/g，RSD值为0.51%，表明方法重复性好。

2.2.10 加样回收率测定 精密称取9份已知质量分数(21.465 5 mg/g)的清热疏肝颗粒(批号： 20150404)0.1 g，置100 mL容量瓶中，分别精密加入黄芩苷对照品溶液(质量浓度2.28 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL，各3份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.4”项下色谱条件进行测定并计算回收率，结果见表 1。

表1 清热疏肝颗粒中黄芩苷的加样回收率试验结果

Table 1 Recovery results of baicalin in Qingre Shugan granules (n=3)

编号样品量/g样品中的量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%10.10202.18951.8243.95596.7920.10232.19591.8243.96496.9330.10212.19161.8243.94095.8540.10232.19592.2804.40997.0650.10152.17872.2804.39897.3460.10202.18952.2804.39196.5670.10342.21952.7364.91798.5980.10312.21312.7364.90598.3990.10292.20882.7364.90298.44平均回收率=97.33%;RSD=0.87%

2.2.11 样品的测定 分别称取3批清热疏肝颗粒(批号：20150404、20150405、20150406)约0.2 g，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，每批平行操作2份。分别按“2.2.4”项下色谱条件测定黄芩苷的峰面积，计算质量分数，结果3批清热疏肝颗粒质量分数的平均值分别为21.493 4、22.068 4、21.897 4 mg/g。

3 讨论

方中黄芩、柴胡、连翘、鱼腥草所采用的薄层色谱条件均在2015年版《中国药典》一部各项药材鉴别基础上作出调整，调整后的方法分离效果较好、比移值适中，且阴性对照无干扰。

本文曾参考2015年版《中国药典》一部柴胡药材鉴别项下收载的薄层方法对处方中的柴胡进行TLC鉴别，结果显示供试品溶液色谱中，与柴胡对照药材溶液色谱相应的位置上有相同颜色的斑点，但供试品斑点拖尾严重、分离效果差且阴性对照有干扰。故将甲醇提取液用水饱和的正丁醇振摇提取2次，合并正丁醇液，再分别用水和氨试液洗涤2次，将乙酸乙酯-乙醇-水(体积比8∶2∶1)展开剂改换为正丁醇-乙酸乙酯-氨试液(体积比4∶1∶5)的上层溶液。结果表明供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，有相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰。

本文曾参考2015年版《中国药典》一部黄芩药材鉴别项下的薄层方法鉴别处方中的黄芩，发现黄芩在紫外光灯(365 nm)下，暗色斑点不易观看，故喷以5%(质量浓度)三氯化铁乙醇溶液进行显色，结果发现日光检视结果较紫外光灯下检视更为明显，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，各斑点分布均匀、清晰，且阴性对照无干扰。

试验过程中还对鱼腥草鉴别进行了硅胶G板与1%NaOH溶液制备的硅胶G板的比较，结果显示：在1%NaOH溶液制备的硅胶G板条件下，对照药材的斑点稍有拖尾，斑点分离效果较差；而在硅胶G板条件下展开，供试品溶液与对照药材溶液的斑点均清晰，阴性无干扰。

处方中黄芩为君药，其黄芩苷的质量分数较高，且其药理作用与本方的疗效具有显著相关性，故选择黄芩苷作为定量测定的指标。本试验曾参照2015年版《中国药典》与相关文献[6-11]，对比了甲醇-0.2%H3PO4系统不同比例流动相的分离效果。结果显示，当甲醇、0.2% H3PO4体积比为 47∶53 时，目标峰分离度理想；且通过方法学验证表明，本方法准确、可靠，重复性好，可作为清热疏肝颗粒中黄芩苷的质量分数测定方法。

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(责任编辑：刘晓涵)

Study on quality standard of Qingre Shugan granules

SUN Dongmei1,2,3,CHEN Qiugu2,LI Yangxue1,3,LI Sumei1,3

(1.GuangdongProvincicalInstitubeofTCM,Guangzhou510095,China; 2.GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510405,China; 3.GuangdongProvincialKeyLaboratoryofResearchandDevelopmentinTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510095)

Objective To establish the quality standard of Qingre Shugan granules．Methods Thin layer chromatography (TLC) was used to identify Radix Scutellariae,Radix Bupleuri,Fructus Forsythiae and Herba Houttuyniae. Baicalin was determined by high performance liquid chromatography (HPLC)． Results The TLC spots of Radix Scutellariae,Radix Bupleuri,Fructus Forsythiae and Herba Houttuyniae were clear with good resolution and free of interference of negative samples．It showed a good linearity for baicalin in the range of 0.114-0.684 μg (r=0.999 9). The average recovery was 97.33%(RSD=0.87%)．Conclusion The method is simple,rapid,reproducible,and could be used for the quality control of Qingre Shugan granules．

Qingre Shugan granules; quality standard; TLC; HPLC; baicalin

2016-06-04

广东省医疗机构中药制剂研发技术平台建设(2013B040200040)

孙冬梅(1969—)，主任中药师，博士生导师，主要从事中药新药研发及中药质量评价研究，Email：564290061@qq.com。

时间：2016-09-30 15:02

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1502.007.html

R284.1

A

1006-8783(2016)05-0601-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016060403