斑马鱼在发育毒理学中应用的安全性评估

欧阳凤

（河南工学院 河南新乡 453003）

斑马鱼在发育毒理学中应用的安全性评估

欧阳凤

（河南工学院 河南新乡 453003）

目前，斑马鱼胚胎已经被广泛应用于发育毒理学研究领域，并取得显著的研究成果。在胚胎发育的致畸、致死原因中，以血管、心脏和神经发育的研究最为广泛。斑马鱼在血管、心脏和神经发育这几个领域研究中的应用处于起步阶段，本文主要分析总结斑马鱼胚胎在血管、心脏和神经发育毒理学研究中的应用。

斑马鱼 胚胎发育 毒理学 应用

在发育毒理学研究领域中，小鼠、爪蟾、斑马鱼等都是较为常用的动物。虽然小鼠在现代遗传学研究中发挥出重要作用，但由于小鼠的胚胎位于母体子宫深处，因此在研究中无法实现发育过程的动态观察。爪蟾是胚胎学研究的良好对象，但由于繁殖较慢，其应用存在时间限制。这就表明上述模型动物不适用于发育毒理学的研究。斑马鱼由于个体小、周期产卵，且产卵周期短、产卵量高、卵大、体外受精、体外发育等特点被广泛应用于胚胎学、发育生物学、分析生物学、毒理学等领域的研究中，被喻为是较为理想的研究型脊椎动物，具有很高的科研价值和应用前景。对于发育早期胚胎发育的研究，斑马鱼的应用具有显著优势，有利于促进有关早期胚胎发育调控事件的研究进展。

1　斑马鱼的生物学特征

斑马鱼俗称花条鱼、蓝条鱼、斑马担尼鱼，隶属鲤科、短担尼鱼属。斑马鱼起源于印度，是一种小型的热带鱼类，染色体数目为50，成体长约3～4cm，孵出后约3个月能够成熟。成熟的雌鱼每隔一周可产几百粒卵子。卵子均为体外受精，体外发育，胚胎发育同步，且速度快，良好发育的温度为25～31℃［1］。细胞培养是获得毒理机制信息的有效途径，其缺陷是无法反映体内细胞的自然环境。采用生物有机体配合基因功能操作，能够快速有效地获得毒性机制。如果运用哺乳动物作为模型，则会增加研究成本，不利于大规模的实验研究，在此情况下斑马鱼显现出巨大的优势。斑马鱼胚胎的透明性和体外发育是其最大优势，有利于对胚胎毒性和畸形效应的动态研究。在德国，斑马鱼胚胎已经成为水质监测的标准模式生物，取代传统运用成鱼进行毒理学试验的研究，充分发挥出斑马鱼的应用价值。

2　斑马鱼作为毒理模式动物的优势

相比于哺乳动物胚胎，斑马鱼胚胎作为发育毒理学的模式动物具有以下优势：

2.1胚胎取材方便

性成熟的斑马鱼在光刺激的环境下能够影响其交配行为，主要利用适当的调节光周期，或合理控制雌鱼和雄鱼的接触时间，就能有效控制斑马鱼的产卵时间，其中一尾雌鱼平均一次能够产100～300枚卵，在这种高产量下一天可以获得足够的斑马鱼胚胎，目前还没有一种哺乳动物具有如此高的排卵量。受精卵的保存主要采用96孔板，有效节约保存成本和空间，这位大量的试验研究提供方便的取材，促进高通量研究的顺利进行。

2.2胚胎发育迅速

斑马鱼的良好发育温度为25～31℃，在此环境下受精后，胚胎会于40min后完成首次分裂，接着每15min逐渐完成每一次的分裂。经24小时胚胎中斑马鱼的脑室、眼睛、耳朵等器官及细胞均能显著呈现出来，这1小时的发育相当于人类1个月的胚胎发育［2］。

2.3易于观察操作

斑马鱼的胚胎主要在体外发育，胚胎具有较高的透明度，这种特点方便对其发育过程及影响因素的观察。试验研究可以动态观察胚胎发育的过程，例如运用示踪标记的方法动态观察某个基因的时空表达情况。斑马鱼受精卵的直径约为1mm，这为显微注射和细胞移植等操作提供有利条件，除此以外，在后期胚胎上还能够运用基因调控技术、全胚胎表达图谱和胚胎原位杂交技术等，为多个系统的发育、功能和疾病研究提供模型。

3　斑马鱼在发育毒理学中应用

3.1斑马鱼胚胎在血管发育毒理学研究中的应用

血管发生和血管生成是斑马鱼血管发育的两个重要过程，其中血管发生是指内皮细胞前体进行分化，并初步形成血管；血管发育是指初步形成的血管内皮细胞逐渐发芽，并形成新的毛细血管。血管内皮生长因子（VEGF）主要作用于血管内皮细胞，并对血管生长调控起到良好作用。目前研究主要集中于对斑马鱼VEGF-A的试验研究，VEGF-A具有促进斑马鱼胚胎血管发生、生长、造血等作用。

首先，斑马鱼能够在短时间内形成完整的循环系统，缩短试验所需时间，提高研究效率。其次，斑马鱼在刚开始发育时期能够充分运用氧气的被动扩散完成呼吸，不需要任何功能性的心血管系统和造血系统，这相比与哺乳动物其胚胎的成活率更高，这就表明斑马鱼胚胎更加适合研究心血管系统早期发育缺陷和发育关键基因功能等。第三，斑马鱼可以作为外源化学物导致心血管系统畸形研究的模式动物。例如在乙醇的血管发育毒性研究领域，研究发现［3］给予斑马鱼胚胎乙醇，胚胎底索分泌的Ang-1和Radar等血管生成因子显著减少，从而影响DA的形成稳定性，这表明乙醇会影响斑马鱼底索的发育。第四，斑马鱼胚胎的血管发育毒性研究对于临床药物安全性的评价具有显著意义。例如在抗血管生成药物的助溶剂研究中，分别采用二甲基亚砜、丙酮、甲醇、异丙醇有机溶剂处理斑马鱼胚胎，结果显示，二甲基亚砜、丙酮适宜浓度小于等于0.1%，甲醇适宜浓度小于等于1%，异丙醇并不能适用于斑马鱼的抗血管生成，有利于抗肿瘤药物有机助溶剂的筛选。另一项研究证实了抗癌药物力达霉素对斑马鱼胚胎血管生成具有显著的抑制作用。最后，斑马鱼血管具有透明性，能够动态观察胚胎中血流动力学参数，便于观察斑马鱼发育的整个过程，这对于获取毒理学实验数据具有显著优势。例如研究给予斑马鱼胚胎不同浓度的咪唑安定，其中1mg·L-1的咪唑安定对胚胎血管发育无影响，10mg·L-1用量会引起体节间和尾部血管的发育受到抑制，20mg·L-1用量会造成发育停滞，这为咪唑安定药物对血管毒性作用提供研究依据。

3.2斑马鱼胚胎在心脏发育毒理学研究中的应用

斑马鱼在发育过程中首先发挥作用的器官就是心脏，心脏控制循环功能。斑马鱼心脏的发育过程主要包括初始分化、出现心跳、血液循环、出现新光卷曲、心脏功能发育完全这几个阶段。心脏发育是一个复杂的过程，需要细胞增殖、迁移、分化及相互作用，还需要多个基因的表达和调控。斑马鱼胚胎心脏可以作为化学物毒性的靶器官，主要利用斑马鱼心脏的透明性进行动态观察，也被广泛应用于中药的安全性评估、环境中有机污染物的心脏发育毒性的研究中。

首先，斑马鱼胚胎心脏应用于中药的安全性评价。例如一项研究［4］将斑马鱼胚胎作为模型动物，研究中药雷公藤红素的心脏毒性，结果显示，雷公藤红素的毒性作用主要表现为心脏线性化、心膜出血、心区细胞堆积等不良反应，且斑马鱼的心率呈现下降趋势。另一项研究给予斑马鱼中药桔梗总苷，研究结果显示斑马鱼的心率逐渐减缓，离子通道中的基因表达水平也显著降低。其次，斑马鱼胚胎广泛应用于环境持久性POPs的心脏发育毒性评价中。研究已经证实，“福美双”杀菌剂的毒性主要表现在会引起心囊水中和心率下降，心脏发育毒性会随着计量的变化而变化。一项研究［5］运用斑马鱼胚胎研究多环芳烃（PAHs）毒性，结果显示多环芳烃的毒性表现具有多样性，不同种类的PAHs的心脏发育毒性是不同的，但靶器官均为心血管系统。其中BAP的毒性作用主要表现为心动过缓、心包水肿、心肌细胞CYP1A显著升高等，BKF的毒性作用表现为心包水肿、循环缺陷、房室回流受阻等，BEP的毒性标志为较低的CYP1A信号，其余无显著心脏毒性和畸形发生。第三，斑马鱼胚胎应用于纳米材料的心脏发育毒性研究中。一项研究给予斑马鱼胚胎纳米银、纳米金和纳米铂处理，纳米银和纳米铂材料的毒性主要表现为心率降低，纳米银还会造成心脏畸形、循环障碍等，而纳米金在处理实验下没有发现显著的毒性作用，这将为环境保护提供参考数据。

3.3斑马鱼胚胎在神经发育毒理学研究中的应用

斑马鱼胚胎时期能够观察到一些运动行为，例如游动、逃避反射等，这些运动行为伴随发育进程逐渐产生。其神经发育的过程重要表现为胚胎出现持续性的肌肉收缩、对于头部刺激能够快速转动尾巴、对于机械刺激能够游动、游动速度达到最大、对触觉表现出成熟的逃避反射，这些行为学发育特点是神经发育毒性研究的重要参考。

有于斑马鱼胚胎具有显著的透明性，因此其模型动物主要适用于常规检测方法中，并将细胞、分子及遗传学等方法相结合，对神经发育毒性进行研究和评价。国外研究运用7种化学物质研究斑马鱼胚胎的神经发育毒性，发现斑马鱼行为学是一种较为简单并能够分析神经整合功能的方法，逐渐形成多种实验模型。国内一项研究［6］观察二氢叶酸还原酶基因对斑马鱼胚胎颅脑发育情况的影响，结果发现对颅脑发育产生较大的影响。另一项研究表明，下调原钙粘附蛋白18（PCDH18）基因对斑马鱼的神经系统发育产生影响，其中PCDH18a和PCDH18b均参与中枢神经系统发育的全过程。国外研究还运用斑马鱼胚胎作为重金属、农药等环境毒物对神经系统毒理机制的研究模型，研究发现，将斑马鱼胚胎早期暴露与镉环境中，会引起小脑发育不全，毒性病理基础为小脑畸形和中后脑分界不清晰等；铅污染在斑马鱼胚胎神经发育中也具有显著的毒性，可以引起游动或行动迟缓等，这都将为金属镉对哺乳动物神经发育的毒性研究提供参考依据。除此以外，面对当前日益研究的环境污染问题，斑马鱼胚胎能够广泛应用于重金属、有机农药等毒性研究中，为高等脊椎动物的生长环境研究提供有效帮助，为环境监测发挥出积极作用。

4　结语

斑马鱼由于自身明显的优势，已经逐渐成为发育毒理学研究中广泛应用的脊椎动物模型，并有效促进发育毒理学研究进展的加快。本文从血管、心脏和神经发育系统出发，分析总结斑马鱼胚胎在实验研究中的应用。但斑马鱼模型也存在一定的局限性，这是由于斑马鱼胚胎、幼鱼和成鱼之间存在差异，在化学筛选过程中要在不同生长阶段进行药物实验，因此会造成结果的不明确；其次，斑马鱼具有亲水性和亲脂性，无法吸收疏水性小分子化合物，因此在筛选化学物时要注意斑马鱼皮肤问题，加强实验验证的准确性和科学性，促进斑马鱼在发育毒理学应用的安全性。

［1］于力群，王厚鹏，朱作言，等.生长激素/催乳素家族配体和受体成员在斑马鱼早期胚胎中的表达比较和交叉活性分析［J］.水生生物学报，2014（5）：809-818.

［2］于学慧，张世栋，张承梅. 发育生物学的理想动物模型——斑马鱼［J］.中国实验动物学杂志，2001（3）：172-175.

［3］Asharani P V，Yi L，Zhiyuan G，et al.Comparison of the toxicity of silver，gold and platinum nanoparticles in developing zebrafish embryos.［J］.Nanotoxicology，2011（1）：43-54.

［4］李运彩，张松林，白芳铭，等.氯代苯和烷基酚类化合物斑马鱼毒性的定量构效关系分析［J］.南方水产，2010（3）：19-23.

［5］严丽锋，顾爱华.利用斑马鱼胚胎进行发育毒理学研究的进展［J］.东南大学学报：医学版， 2012， 31（3）：346-350.

［6］王蕊， 殷浩文.斑马鱼胚胎发育中适宜的毒理学指标分析［J］. 环境与职业医学，2004，21（2）：88-89.

R114

A

1674-2060（2016）05-0086-02

欧阳凤（1976—），女，重庆人，硕士研究生，讲师，研究方向：动物资源保护与利用。