黄芪总提取物促进PBMC对肝癌细胞的体外杀伤作用

王金全，陈启助，黄树林，薄华本

(广东药学院 广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006)



黄芪总提取物促进PBMC对肝癌细胞的体外杀伤作用

王金全，陈启助，黄树林，薄华本

(广东药学院 广东省生物技术候选药物研究重点实验室，广东 广州 510006)

摘要:目的 观察黄芪总提取物(TAE)与人外周血单个核细胞(PBMC)联用对肝癌细胞株BEl-7402的体外杀伤作用。方法 MTT法及流式细胞术分别检测TAE与PBMC在单独、联合应用情况下对BEL-7402细胞的杀伤活性，Burgi修正公式评价药物联合应用对细胞杀伤效果是否具有协同作用，ELISA法检测TAE对PBMC分泌IFN-γ、TNF-α细胞因子的影响。结果 TAE与PBMC联用对肝癌细胞BEl-7402具有协同杀伤作用。TAE预先与PBMC孵育后两者协同杀伤作用明显增强。TAE可以刺激PBMC分泌IFN-γ、TNF-α细胞因子。结论 TAE可以促进PBMC对肝癌细胞的体外杀伤能力，二者联用具有协同杀伤作用，其作用机制可能是TAE刺激PBMC分泌IFN-γ和TNF-α以增强免疫杀伤能力。

关键词:黄芪； PBMC； 协同作用； 抗肿瘤活性； 免疫细胞治疗

原发性肝癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，其起病隐匿且发展迅猛，大多数患者在临床确诊时已到晚期失去手术机会[1]。故药物治疗是其重要的治疗手段之一，然而目前临床应用的化疗手段毒副作用大，疗效不甚理想，所以寻找新的药物及治疗方法成为当务之急。黄芪(astragalus)是豆科多年生草本植物荚膜黄芪和内蒙黄芪的干燥根，黄芪总提物 (total astragalus extract,TAE)是从黄芪中提取的有效部位群。黄芪入药始载于《神农本草经》，其性温、味甘，具有补气升阳、益气固表、利尿托毒敛疮生肌等功效[2]。现代科学研究发现，黄芪除具有传统药效之外，还具有抗炎、抗氧化、免疫调节以及抑制肿瘤细胞生长等作用[3]。有研究报道黄芪可以直接杀伤肿瘤细胞，但另有研究显示黄芪是通过调节机体功能来抑制肿瘤细胞[4]。为明确黄芪抗肿瘤作用及相关机制，本文采用TAE与人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)单独或者联合应用，考察二者对肝癌细胞BEL-7402的杀伤活性及影响因素，以期为临床肝脏恶性肿瘤的治疗提供一定的治疗思路及方法。

1材料与方法

1.1主要材料、试剂及仪器

黄芪总提取物为本室制备，黄芪水煮沸提取2 h，提取液趁热过滤，残余药渣用相同的方法重新提取1次，合并2次提取液，用旋转蒸发仪浓缩药液成含生药质量浓度1 g/mL的水煎液，4 ℃储存备用。淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物制剂技术公司)；1640和DMEM培养基(Gibco公司)；胰蛋白酶(Amresco)；胎牛血清(Gibco公司)；MTT(Sigma)；人肿瘤坏死因子α(TNF-α)、人干扰素-γ(IFN-γ)检测试剂盒(ELISA法，上海江莱生物科技有限公司)；CO2孵箱(NAPCO)；iMark酶标仪(Biorad)；流式细胞仪(Coulter Elite)。

1.2肿瘤细胞培养

人肝癌细胞株BEL-7402为本室保存。细胞置于37 ℃，5%(φ)CO2饱和湿度的培养箱中，在含有10%(φ)新生胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基中培养和传代。如无特殊说明，实验所用细胞均处于对数生长期。

1.3淋巴细胞的分离和培养

取健康人外周血，Ficoll-Hapaque密度梯度离心法分离健康供血者外周血PBMC,用1640将细胞调至2×106/mL。移至培养瓶中竖立培养(20 mL/瓶)，再加入10%胎牛血清，20 U/mL的IL-2，置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中待用。

1.4单独及联合用药体外细胞杀伤活性的测定

BEL-7402细胞置于37 ℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中生长至对数期，0.25%胰酶消化收集细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞密度大约在1×104/mL，每孔100 μL接种于96孔板。细胞分为4组：单TAE组，即不同浓度的TAE与靶细胞(TC)BEL-7402共孵育；单PBMC即效应细胞(EC)组，不同效靶比(EC/TC)细胞共孵育；联合作用组，不同浓度的TAE+不同效靶比的(EC/TC)细胞共孵育共孵育；BEL-7402对照组。同时设置调零孔、对照孔，每组设定6复孔，各组细胞加药后作用48 h，MTT法检测细胞杀伤率，步骤见文献[5]。抑制率=[1-(实验孔A值-效应细胞对照孔A值)/靶细胞对照孔A值]×100 %。

1.5Annexin V/PI双染检测单独及联合用药诱导细胞凋亡

收集BEL-7402细胞，调整细胞悬液浓度，6孔板中每孔接种约2×105个细胞，置于培养箱中培养约24 h。换液，按下述分别单独加入TAE或PBMC以及联合用药。单TAE组：40 mg/mL；单PBMC组，效靶比：20∶1；联合作用组，40 mg/mL的TAE+效靶比(20∶1)PBMC共孵育；BEL-7402对照组加入相同体积的溶剂，各组加药后均孵育48 h。小心吸去上清及悬浮的PBMC，0.25%胰酶消化收集细胞，1 000 r/min，离心5 min，去上清，加入100 μL PBS重悬，用滤网过滤。1 000 r/min，离心5 min，去上清，加入100 μL 1× Binding Buffer重悬细胞，分别加入5 μL 488 annexin V和1 μL PI，室温孵育15 min，加入400 μL 1× Binding Buffer，用FACSCanto Ⅱ流式细胞仪上机检测。

1.6TAE预先孵育联合给药对肿瘤细胞的杀伤作用

选取合适浓度的TAE与PBMC预先孵育24 h，再作用于BEL-7402靶细胞48 h，MTT法检测细胞抑制率。同时用相同浓度的未预先与TAE孵育的PBMC做对照。

1.7TAE对PBMC分泌IFN-γ及TNF-α的影响

选取合适浓度的TAE与PBMC预先孵育24 h，离心，取细胞培养上清，ELISA法检测IFN-γ及TNF-α含量，具体步骤参照试剂盒说明书，同时用相同浓度的未预先与TAE孵育的PBMC做对照。

1.8统计学处理

2结果

2.1TAE与PBMC单独及联合用药对肿瘤细胞的杀伤作用

单独应用TAE或者PBMC都可在体外对人肝癌细胞BEL-7402产生一定的杀伤作用。细胞形态学检测显示，阴性对照组显示BEL-7402呈梭形，生长正常(图1A)；TAE处理组部分肿瘤细胞体积缩小，核质浓缩，核膜核仁破碎，形成凋亡小体(图1B)。PBMC处理组可见小的圆形淋巴细胞散在分布，部分淋巴细胞集中在肿瘤细胞周围，肿瘤细胞生长受到明显抑制，出现拉丝融合现象(图1C)。TAE与PBMC联合用药组肿瘤细胞损伤更为明显(图1D)。

为明确TAE与PBMC对BEL-7402细胞的杀伤作用的机制，检测了上述处理对细胞所致的凋亡情况。结果显示，TAE或者PBMC都可在体外诱导BEL-7402发生凋亡，但是两者联合应用后，癌细胞的凋亡率明显增大。见图2。

A.对照组； B.TAE处理组(40 mg/mL)； C.PBMC处理组(效靶比:20∶1)； D.TAE(40 mg/mL)与PBMC(效靶比:20∶1)联合处理组。

图1TAE与PBMC单独及联合用药处理后BEL-7402细胞的形态学表现(200×)

Figure 1Morphology of BEL-7402 cells after treated by TAE with or without PBMC (200×)

A.对照组； B.TAE处理组(40 mg/mL)； C. PBMC处理组(效靶比:20∶1)； D.TAE(40 mg/mL)与PBMC(效靶比:20∶1)联合处理组。

图2TAE与PBMC单独及联合用药处理后BEL-7402细胞的凋亡情况

Figure 2Apoptosis of BEL-7402 cells after after treated by TAE with or without PBMC

2.2TAE与PBMC单独及联合用药协同作用

结果见表1。MTT检测结果显示，不同剂量TAE和各种效靶比的PBMC联用后，经Burgi修正公式计算的Q值均大于1.15，表明两者具有较强的协同作用。从表1中还可以发现，各组剂量的TAE与PBMC的配比中，随PBMC浓度的增高，Q值逐渐降低，协同作用逐渐减弱。

2.3TAE预先孵育联合给药对肿瘤细胞的杀伤作用

分别选取TAE与PBMC的中间剂量进行联合给药，预先将PBMC与不同浓度的TAE孵育24 h。结果显示，其联合作用的最终细胞抑制率显著高于对应的未预先孵育组，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，见表2。说明TAE能明显促进PBMC对肿瘤细胞的杀伤作用。

表1TAE与PBMC单独及联合用药对肿瘤细胞的杀伤作用

Table 1Synergistic antitumor effect of TAE with PBMC

剂量/(mg·mL-1)TAEPBMC(EC/TC)抑制率/%协同作用值(Q)协同作用程度0513.1±2.3未计算未计算01028.1±3.1未计算未计算02036.8±3.4未计算未计算10014.3±1.9未计算未计算20024.1±3.2未计算未计算40030.6±3.4未计算未计算10546.5±4.21.82++20566.7±4.51.96++40582.6±5.02.08++101061.4±5.21.59++201072.2±4.31.58++401083.3±4.31.66++102071.8±3.21.57++202082.1±4.31.58++402089.2±4.31.59++

表2TAE预先孵育联合用药对肿瘤细胞的杀伤作用

Table 2Synergistic antitumor effect when TAE pretreatment

剂量/(mg·mL-1)PBMC(EC/TC)TAE抑制率/%10(预先孵育TAE)1068.5±4.1*10(未预先孵育TAE)1060.6±5.210(预先孵育TAE)2082.2±6.7*10(未预先孵育TAE)2071.4±5.310(预先孵育TAE)4093.1±5.1**10(未预先孵育TAE)4080.7±6.4

与相同剂量未预先孵育TAE处理组比较：*P<0.05,**P<0.01。

2.4TAE对PBMC分泌IFN-γ及TNF-α的影响

结果见图3。预先与TAE孵育后，PBMC培养液上清中的IFN-γ与TNF-α的含量明显上升，且随TAE的剂量增加而升高，说明TAE可以促进PBMC分泌IFN-γ与TNF-α。

20001600120080040004003002001000未预先孵育TAE预先孵育TAE********102040ρ(TAE)/(mg?L-1)****未预先孵育TAE预先孵育TAEBA102040ρ(TAE)/(mg?L-1)ρ(IFN-γ)/(mg?L-1)ρ(IFN-α)/(mg?L-1)

A.对PBMC分泌IFN-γ的影响; B.对PBMC分泌TNF-α的影响； 与相同剂量未预先孵育TAE处理组比较：**P<0.01。

图3TAE对PBMC分泌IFN-γ及TNF-α的影响

Figure 3Effect of TAE on the secretion of IFN-γand TNF-αby PBMC

3讨论

肝癌是临床上恶性程度较高的肿瘤之一，常规单一的手术或者化疗很难取得理想效果。近年来，综合治疗逐渐成为积极有效的治疗方法，综合治疗一般包括前期的手术治疗，术后进行放化疗加中药及生物治疗，尤其是中药和生物治疗相配合具有较小的毒副作用得到较好临床治疗效果[7]。近年来黄芪在肿瘤的临床治疗中应用较为广泛，具有减轻放化疗毒副作用、提高疗效和患者生活质量的效果[8]。PBMC为外周血中分离出的具有单个核的混合细胞群，其中主要包括淋巴细胞、单核细胞(monocyte)、树突状细胞等免疫细胞。PBMC经某些因素刺激诱导后，活化的淋巴细胞可分泌一种IFN-γ的具有抗病毒、抗增殖及免疫调节作用的细胞因子；另外活化的单核/巨噬细胞可以产生TNF-α，能杀伤和抑制肿瘤细胞，这些即是肿瘤生物免疫治疗的基本元理论[9]。然而目前关于黄芪的抗肿瘤机制以及其与免疫细胞相互影响方面研究较少。

本研究结果显示，黄芪总提取物TAE与PBMC在体外均可以抑制肿瘤细胞生长，然而其强度较弱。两者单独应用时，在抑制率达到30%左右时再增加剂量其抑制率上升不明显。但是，二者联用时抑制率显著上升，统计分析结果表明二者具有较强的协同杀伤作用。先前有研究报道黄芪的抗肿瘤作用与其调节机体的免疫功能密切相关[10]。为进一步观察TAE对PBMC免疫杀伤功能的影响，本研究将PBMC预先与TAE孵育后再联合攻击肿瘤细胞，结果显示对肿瘤细胞抑制率显著高于未预先孵育组，表明TAE可能是通过某种途径首先刺激活化了PBMC，继而增强了其杀伤肿瘤细胞的功能。为了明确TAE对PBMC是否具有刺激活化PBMC的作用，检测了TAE预先与PBMC孵育后细胞培养液上清中IFN-γ与IFN-α两种细胞因子的含量。结果表明，TAE预先孵育能够显著增加PBMC中IFN-γ与TNF-α的分泌量，并且分泌量随TAE剂量的增加而升高。

综上所述，TAE可以刺激活化PBMC，二者联合应用对于肝脏肿瘤细胞BEL-7402具有协同杀伤效果，其作用机制可能是TAE刺激PBMC分泌IFN-γ、TNF-α，使PBMC活化而增强对肿瘤细胞的杀伤能力。基于此，将中药黄芪与生物免疫治疗应用于肝癌的临床治疗，具有广阔的应用前景。

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(责任编辑：幸建华)

Total astragalus extract enhances the cytotoxicity of PBMC against liver cancer cellsinvitro

WANG Jinquan,CHEN Qizhu,HUANG Shulin,BO Huaben

(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofBiotechnologyCandidateDrugResearch,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:Objective To investigate the synergistic cyctoxic effect of total astragalus extract (TAE) combining with human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) on BEL-7402 cells in vitro. Methods MTT assay and flow cytometry were employed to test the cytotoxicity of TAE with or without PBMC on BEL-7402 cells. The modified Burgi formula was used to analyze the effect of two treatments. ELISA was used to detect the IFN-γ and TNF-α level of PBMC after TAE treatment. Results TAE combining with PBMC produced a synergistic cytotoxic effect on BEL-7402 cells. The synergistic degree was increased when PBMC was pretreated with TAE. TAE induced the secretion of IFN-γ and TNF-α by PBMC. Conclusion TAE enhances the cytotoxicity of PBMC against liver cancer cells. TAE combining with PBMC may produce a synergistic cyctotoxic effect,by which mechanism is related to upregulation of IFN-γ and TNF-α secretion and cytotoxicity of PBMC.

Key words:astragalus; peripheral blood mononuclear cells; synergistic cyctoxic effect; antitumor activity; immune cell therapy

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015102302

中图分类号:R285.5

文献标志码:A

文章编号:1006-8783(2016)01-0066-05

作者简介：王金全(1979—)，男，讲师，主要从事抗肿瘤药物研究，Email：solo_wjq@126.com；通信作者：薄华本(1981—)，男，讲师，主要从事中药药理研究，Email：ben1702@126.com。

基金项目：国家自然科学基金项目(81403317)；广东省青年创新人才基金项目(2014KQNCX140)

收稿日期：2015-10-23

网络出版时间：2016-01-12 11:10网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160112.1110.004.html