SSR标记技术在葡萄品种鉴别及遗传育种上的应用

董志刚,　刘政海,　李晓梅,　谭　伟,　王新平,　茹慧玲,　唐晓萍*

1.山西省农业科学院果树研究所, 山西 太谷 030815;

2.山西农业大学, 山西 太谷 030801



SSR标记技术在葡萄品种鉴别及遗传育种上的应用

董志刚1§,刘政海2§,李晓梅1,谭伟1,王新平1,茹慧玲1,唐晓萍1*

1.山西省农业科学院果树研究所, 山西 太谷 030815;

2.山西农业大学, 山西 太谷 030801

摘要：SSR标记因其数量多、重复性好、出现频率高和共显性遗传等优点在植物的种质资源品种鉴别、遗传育种等方面得到广泛应用。简要介绍了SSR标记在葡萄上的发展和葡萄遗传多样性分析、品种鉴定、DNA指纹图谱构建和遗传育种等方面的应用，并对SSR标记未来在葡萄育种应用的研究方向作出了展望。

关键词：葡萄；SSR标记；遗传育种；遗传多样性

葡萄(Vitisvinifera)为葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis)的多年生藤本植物，在全世界范围内广泛栽培，其种植历史久远，可以追溯到约8 000多年前[1]。葡萄在其进化发展过程中形成了许多种群、品种群和变种群，且因其基因组杂合度高，不同种间以及品种间经济性状、抗逆性状等方面存在着极其丰富的变异，导致种质资源鉴定分类和抗性基因利用十分困难[2]。随着生物技术的迅速发展，区别于以形态学标记为主的葡萄种质资源分类，从分子水平对物种的亲缘关系进行分析更加直接准确。

SSR标记是一种基于PCR技术的DNA标记方法，具有数量多、重复性好、出现频率高和共显性遗传等优点，目前，在EST数据库的利用、系谱重建、品种鉴别及新品种保护等领域展示出巨大的发展潜力。在葡萄遗传多样性分析、品种鉴定、遗传指纹图谱构建和葡萄育种等方面得到了较广泛的应用。本文综述了SSR分子标记在葡萄品种鉴别及遗传育种方面的研究进展，并对SSR在未来葡萄育种方面的应用进行了展望，以期为葡萄的品种鉴别和遗传育种研究提供参考。

1不同SSR标记技术在葡萄中的应用

1.1EST-SSR分子标记在葡萄中的应用

近几年随着国内外对功能基因研究的不断深入，产生了许多EST数据库，其中包含大量的SSR分子标记，EST-SSR分子标记技术随之产生，因其保守程度更高，转移率也较大，不同物种的通用性强，且经济便捷，迅速得到应用。王娟等[3]通过构建聚类树状图分析葡萄不同品种间的亲缘关系，验证了EST-SSR技术在对葡萄种质分类鉴定中的可行性。通过筛选16对EST-SSR引物对62份葡萄材料进行分子水平的比较分析，发现62份材料相似系数在0.48~1.00之间，为葡萄亲缘关系探讨提供了可靠的分子生物学依据。

1.2cpSSR分子标记在葡萄上的应用

叶绿体微卫星 (chloroplast SSR, cpSSR)是近几年发展起来的一种基于叶绿体基因组的分子标记技术。叶绿体基因组相比核基因组具有以下特点：分子量小、结构简单、其中多为环状双链DNA；为原核性，序列保守，进化速率慢；具有单亲遗传特性，不参与基因重组，为独立遗传进化。这些特性决定了cpSSR对植物进行系统性和进化学研究具有很大的优势。易官美等[4]利用cpSSR分子标记对榧树10个自然分布群进行了遗传多样性分析，解释了榧树经历历史遗传漂变形成单倍型分布式样的重要原因。陈平等[5]利用cpSSR引物对苎麻属进行亲缘分析，在22对引物中筛选出5对引物，共扩增出16条多态带，聚类分析分为3类，结果与传统方式一致，而且其多态比例为22.73%，表明cpSSR具有较好的通用性。开发适宜的cpSSR引物，在葡萄起源研究和亲缘关系鉴定方面必将得到极大的应用。

1.3ISSR分子标记在葡萄上的应用

ISSR(inter-simple sequence repeat)标记技术也是在SSR基础上发展起来的一项新型标记技术，由于其引物设计比SSR简单，不需像SSR引物那样通过测序获得SSR两侧的单拷贝序列，开发费用较低，同时，与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，多态性高、重复性好，能够提供更多的基因组信息。目前，ISSR标记已广泛应用于植物品种鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样性、进化及分子生态学研究中。李继洋等[6]对19个新疆葡萄品种进行了分析，利用2条ISSR引物构建了14个葡萄品种的DNA指纹图谱，提供了利用ISSR分析葡萄品种亲缘关系和遗传多样性的新方法，建立的葡萄指纹图谱为今后探索葡萄种质资源奠定了基础。

2SSR标记在不同葡萄研究领域中的应用

2.1SSR标记在葡萄遗传多样性中的应用

遗传多样性是指同一物种种内的性状差异，能够反映一个物种适应环境的能力和所具有的被改造、利用的潜力大小，是育种工作的基础[7]。葡萄品种繁多，包括大量天然杂交品种和实生选育品种，SSR标记的高多态性对于如此繁多复杂的品种进行判定提供了有效手段。郝宇等[8]、方连玉等[9]分别对供试葡萄种质资源进行了遗传多样性分析。Baneh等[10]利用13条葡萄染色体上的23个SSR标记位点，研究了伊朗葡萄的遗传演化及其遗传多样性，发现了一批有价值的葡萄种质资源。郭春苗等[11]利用SSR分子标记技术进行了葡萄品种(系)遗传多样性分析与指纹图谱构建，并对新疆44个相对适宜制干葡萄品种(系)进行了遗传多样性研究。

2.2SSR标记在葡萄品种鉴定中的应用

葡萄是一个历史悠久的物种，目前已知有8 000个以上的品种，分布在世界广大地区，并且葡萄品种极易发生芽变变异，这使得葡萄同物异名及同名异物的现象较多，因此在葡萄研究和生产实践中，品种鉴别成为重要环节之一。之前的研究主要利用葡萄的形态学、生理学、农艺性状特征进行鉴定和分类，但由于基因和环境的互作影响，这些鉴定方法具有很大局限性。利用SSR标记可对葡萄品种进行快捷准确的鉴定，同时可对其亲缘关系进行分析。Bowers等[12]应用SSR 技术成功鉴定了酿酒葡萄品种赤霞珠的亲本是品丽珠和索维浓。吴子龙等[13]利用9对多态性较高的SSR引物区别了8个山葡萄及山欧杂种葡萄品种。

2.3SSR标记在构建葡萄DNA指纹图谱中的应用

随着人们对品种保护意识的增强，许多植物开始构建DNA指纹图谱。利用SSR分子标记技术构建葡萄的DNA指纹图谱，可为保护葡萄品种的自主知识产权、鉴定和检测葡萄品种苗木真实性和纯度提供客观、科学和准确的技术保障。

杜晶晶等[14]利用SSR标记技术为中国农业科学院国家葡萄资源圃80份葡萄材料构建了分子身份证编码。通过筛选后的SSR引物对葡萄种质进行了区分，平均一对引物区分种质8.9份，实验结果更加准确，实验方法更加简便，使得利用SSR标记构建葡萄种质分子身份证成为可能。Warren等[15]对21个葡萄品种和4个杂交种后代的110份资源进行SSR指纹图谱分析，结果发现，已有研究划分的归属于2个不同种的葡萄资源拥有完全相同的SSR指纹图谱，表明它们拥有相同的基因型，可能是同物异名。李雪雁等[16]采用SSR标记建立了75份葡萄品种DNA指纹图谱体系；李继洋等[6]利用2条ISSR引物构建了14个品种的DNA指纹图谱，图谱的建立为葡萄品种鉴定和亲缘分析提供了理论依据。尹玲等[17]为我国近几年新育成的葡萄品种建立了指纹图谱，更清晰的追溯了他们的亲缘关系，完善了我国葡萄品种数据库。其研究表明，昌黎7号、昌黎8号、蜜光、春光、宝光和昌黎21号等6个4倍体品种亲本均为巨峰×早黑宝的后代。Troggio等[18]以SNP技术为基础建立了欧洲葡萄的遗传图谱，此图谱的构建使用了483个SNP标记、132个SSRs标记和379个AFLP标记，为SSR标记技术在亲缘关系更近的品种、品系的鉴别提供了依据。通过分子标记绘制的指纹图谱具有个体特异性，能准确、快速鉴定品种或品系，该技术为作物育种和种质管理提供了极大的便利，有利于推动我国果树苗木向着规范化、制度化和法制化的方向快速发展。

2.4SSR标记在葡萄育种中的应用

赖呈纯等[19]利用ISSR分子标记技术对95份葡萄品种(系)资源进行了遗传多样性和亲缘关系分析，结果表明，12条引物扩增出160个清晰可辨的位点，品种间的遗传相似系数为0.55~0.99，聚类分析结果表明，95份葡萄资源划分为3大类：欧亚种、欧美杂种和东亚种群。Li等[20]通过利用与无核相关的分子标记进行早期目标性状的筛选，解释了葡萄种子败育的机制。陶红霞等[21]利用SSR标记对黑心病基因定位，寻找与抗性目标性状紧密连锁的分子标记，探讨了黑心病的遗传基础，为培育抗黑心病品种提供了重要方法。SSR分子标记为发现丰富的遗传品种和种质资源提供了有效的手段，在杂交前通过SSR分子标记对预选亲本的亲缘关系进行分析，为育种亲本的选配提供了更为明确的方向性和目标性，为优良基因的有效利用和进行分子标记辅助选择育种提供了理论支持。

3展望

随着DNA分子标记技术在各方面的应用，SSR标记的开发更加快速。SSR分子标记将和其他类型的标记一起在葡萄遗传多样性、品种鉴定、遗传图谱和育种等方面得到更加广泛的应用，在进行芽变品种的鉴别、嫁接苗砧木品种的鉴定、葡萄加工品种的筛选方面展现更大的潜力[21,22]。

我国野生葡萄资源丰富，而且变异类型多样，而这些野生品种往往具有较高的抗寒性、抗病性等特性[23]，SSR 分子标记可以为利用和保护好这些宝贵的种质资源的相关研究提供更多帮助。科研工作者已将SSR分子标记技术应用到葡萄抗病性研究中，并取得了一定进展。这些研究将有利于对杂种进行早期抗性选择，缩短育种周期，大大提高育种效率。

在今后葡萄遗传育种的研究中，SSR分子标记将有越来越大的发展空间，我们可以通过SSR分子标记构建葡萄属植物的系统发育树，建立我国葡萄资源指纹图谱数据库，充分利用我国丰富的葡萄资源，通过种间杂交、芽变体筛选，定位我国葡萄资源的抗性和品质基因，以及预测杂交优势，使育种更具方向性和目的性。

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Application of SSR Markers in Variety Identification and Genetic Breeding ofVitisvinifera

DONG Zhi-gang1§, LIU Zheng-hai2§, LI Xiao-mei1, TAN Wei1, WANG Xin-ping1, RU Hui-ling1, TANG Xiao-ping1*

1.PomologyInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,ShanxiTaigu030815,China;2.ShanxiAgriculturalUniversity,ShanxiTaigu030801,China

Abstract:SSR(simple sequence repeat) has been widely used in the genetic breeding and germplasm resources research in recent years, because it has the characters of abundant quantity, reproducibility, high polymorphic, codominant inheritance and so on. The paper reviewed the application of SSR molecular markers in grape genetic diversity, variety identification, DNA fingerprint construction and genetic breeding. The application prospect of SSR markers in grape breeding was also presented.

Key words:Vitis vinifera; SSR markers; genetic breeding; genetic diversity

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.10

作者简介：§董志刚与刘政海为本文共同第一作者。董志刚，副研究员，博士，研究方向为葡萄遗传育种及种质资源鉴定评价。E-mail:gssdzg@163.com。刘政海，硕士研究生，研究方向为酿酒葡萄品种选育及种质资源鉴定评价。Tel：0354-6215015，E-mail：gssdzg@163.com。*通信作者：唐晓萍，研究员，博士，研究方向为葡萄栽培育种。Tel：0354-6215015，E-mail：txp-19590401@163.com

基金项目：山西省农业科学院博士基金(YBSJJ1202)资助。

收稿日期：2015-11-27; 接受日期：2016-01-12