绿色荧光蛋白裸小鼠的培育及应用进展

方　天,　恽时锋（南京军区南京总医院比较医学科, 南京 210002）

绿色荧光蛋白裸小鼠的培育及应用进展

方天,恽时锋
（南京军区南京总医院比较医学科, 南京 210002）

绿色荧光蛋白（GFP）裸小鼠最初是为肿瘤研究而培育，是同时具有T淋巴细胞缺陷和系统表达GFP基因的裸小鼠。近20年来，学者们对其生物学特性进行了广泛而深入的研究，为该小鼠模型的应用奠定了基础。

绿色荧光蛋白（GFP）； 裸小鼠； 免疫学特性； 肿瘤模型

自1962年Shimomura 等［1］从水母（Aequorea victoria）中提取绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）以来，GFP几乎应用于各个科学领域；GFP广泛作为报告基因用于检测特殊细胞中启动子的活性［2］。同时，GFP能与目的蛋白组成一个嵌合体用于检测蛋白的功能、位置和表达情况［3］；也经常应用于基因治疗［4］和GFP融合蛋白的定量检测［5］。随着GFP等荧光染料和影像技术的发展，体内成像取得了巨大进步，这使得研究宿主微环境内不同细胞在细胞水平和分子水平上的相互作用成为可能［6］。Ikawa等［7］第一次报道了系统性表达GFP的转基因小鼠，GFP转基因小鼠虽然可用于癌症生物学特性的研究, 但容易对接种的癌细胞或者肿瘤组织出现免疫排斥。为了降低免疫排斥反应, 研究者致力于将GFP基因导入裸小鼠。近20年, 已有系统性表达GFP、红色荧光蛋白（red fluorescent protein, RFP）和青色荧光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）裸小鼠的报道［8-10］。GFP裸小鼠应用广泛, 特别是在癌症研究领域； GFP裸小鼠模型帮助解释间质细胞在癌细胞存活和转移中的作用［11,12］。另外,由于GFP裸小鼠没有毛发, 整体成像更具有优势［13］。

本实验室于2005年从美国Jackson实验室引进表达GFP的C57BL/6-Tg（ACTB-EGFP）10sb/J小鼠，与普通BALB/c裸小鼠进行杂交繁育，经过筛选，选育出GFP裸小鼠，并对该小鼠进行了十多年精心培育和对生物学特性的研究探索。本文作者将对GFP裸小鼠的生物学特性及其应用进行综述，为动物模型，特别是肿瘤模型的研究应用者，提供有价值的参考资料。

1　GFP裸小鼠的来源

普通裸小鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠,目前已成为医学生物学研究领域中不可缺少的实验动物模型，特别是在肿瘤学、免疫学、药品与生物制品的安全性评价及有效药品的筛选等实验方面，具有特殊应用价值［14］。目前已将裸基因（nu）导入不同近交系动物，成为系列动物模型，我国目前所应用的自发性免疫缺陷小鼠，主要是BALB/c遗传背景的裸小鼠。

本实验室培育的GFP裸小鼠是将GFP基因导入BALB/c-nu/nu小鼠而得。具体培育过程：通过（GFP）C57BL/6转基因小鼠与BALB/c裸小鼠进行杂交，获得子一代（F1）代，选取F1代小鼠进行自交，产生子二代（F2）代，从F2代中选择带绿色荧光的雄性裸小鼠与雌性荧光杂合子，进行全同胞交配，获得的GFP裸小鼠再与BALB/c小鼠进行回交，回交后代再自交，产生子三代（F3）代，F3代回交后代再自交，产生子四代（F4）代，如此重复，直至第十五代（F15）代，便可成功选育出在体内能稳定表达GFP的裸小鼠。

2　GFP基因表达特点

近年来，无胸腺裸小鼠作为动物模型，为实验免疫学、实验肿瘤学提供了新的工具［15,16］。而GFP，无需作用底物或共同作用物，在荧光激发下可以直接发光, 性质稳定，已成为细胞生物学以及分子生物学中应用最广泛的分子标记之一［1,17］。1980年, Gordon等［18］用显微注射方法获得了2只转基因小鼠。1995年, Ikawa等［7］采用GFP报告基因，成功建立了GFP转基因小鼠。荧光成像具有操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，在活体动物体内成像中得到广泛应用［19-21］。而表达GFP的裸小鼠因自身含有标记蛋白与普通裸小鼠相比而具有明显优势，在生物医学领域有其特殊应用价值。

在荧光显微镜下, 本实验室培育的GFP裸小鼠大部分器官都表达绿色荧光，包括心脏、肺脏、脾脏、胰腺、食管、胃和十二指肠，其中皮肤、血细胞、肌肉均表达绿色荧光［22］。初步研究结果显示，该GFP转基因裸小鼠既保留了裸小鼠的生物学特性，在全身组织器官中又能稳定表达GFP。

本科室尤金炜等［23］进一步利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）分子技术检测GFP基因在不同日龄的GFP裸小鼠体内的表达情况，得出结论：胰腺、心脏、皮肤等主要器官中均检测到表达，其中在胰腺中相对表达量最高，其次是心脏、皮肤、全脑和睾丸，而在肠道、肺脏、肾脏、脾脏和肝脏中的相对表达量较少。GFP在各种组织中表达量的差异，为科学研究中选择疾病模型及移植供体提供了依据。

3　GFP裸小鼠生物学特性

3.1生理生化特点

实验动物作为现代科学技术中“活的试剂”、“活的精密仪器”，血液学、生理生化常数是鉴定其遗传品质的重要依据［24］。尤金炜等［25］报道，GFP裸小鼠与对照组BALB/c裸小鼠比较, 虽然它是在BALB/c裸小鼠的基础上构建成功的，但在生理、生化等指标上确实存在差异，9项生理指标有5项差异显著，其中白细胞总数（WBC）、平均血红蛋浓度（MCHC）差异极显著；WBC也通常被称为免疫细胞，是监测机体的免疫防御功能，现已成为免疫力低下动物模型的重要参考指标之一，检测结果显示两者虽然差异极显著, 但是均远低于正常小鼠的WBC，这与本文作者方天等［26］报道结果一致。12项生化指标中除了尿酸（UA）差异显著，尿素（URE）、葡萄糖（GLU）差异极显著之外，整体差异性不大。该实验选择的GFP裸小鼠与贺晓玉等［27］报道的GFP小鼠在生理生化数值上有一定的差异性，但是在与同样条件对照组的差异性结果基本一致。GFP裸小鼠在免疫指标WBC、肾功能指标URE和UA以及血糖指标GLU上与对照组的差异性十分明显, 但是影响此结果的因素是否为外源基因GFP的导入及其发生机制尚需进一步研究。该实验检测结果还表明, GFP裸小鼠的血液生理、生化指标在雌雄性别间均存在差异, 对照组BALB/c裸小鼠雌雄性别间也存在差异。这种雌雄间的差异性与田小芸等［28］报道的转基因小鼠及王冬平等［29］报道的近交系与远交群小鼠所得出结果一致。但是GFP裸小鼠在雌雄间差异较对照组更为明显, 统计结果显示, GFP裸小鼠在白蛋白（ALB）、球蛋白（G）、红细胞分布宽度（RDW）、平均血红蛋白含量（MCH）、平均血红蛋浓度（MCHC）、血小板计数（PLT）等指标在雌雄间存在差异。可见品种、性别因素对血液学指标有一定影响, 因此GFP裸小鼠在实际应用中要考虑雌雄间差异。

3.2免疫学特性

GFP裸小鼠是在裸小鼠的基础上培育，故其T细胞活性大致与裸小鼠相似，一定程度上保持了裸小鼠的免疫学特性，但外源基因GFP的导入或导致免疫特性改变。脾脏是机体内最大的外周免疫器官［30,31］, 脾脏淋巴细胞数量多少可在一定程度上反映机体免疫功能的高低［32,33］。本文作者方天等［27］实验表明，28日龄GFP裸小鼠脾脏指数明显高于14日龄、49日龄和70日龄的GFP裸小鼠（P＜0.05），可能是脾脏在14日龄到28日龄生长发育速度快，而28日龄后则基本停止脾脏个体发育。与普通裸小鼠相比，同一日龄GFP裸小鼠脾脏淋巴细胞数较少、淋巴细胞密度稀疏（P＜0.05）； GFP裸小鼠不同日龄组之间比较结果，28日龄之后，随日龄增长，淋巴细胞数呈减小趋势（P＜0.05）。这从一定程度上说明，GFP裸小鼠与同一日龄普通裸小鼠相比较，免疫功能更为低下； 并且GFP裸小鼠随日龄增长，免疫功能有下降趋势。该实验结果反映外源基因（GFP基因）会对脾脏形态及其功能产生一定的影响。关于外源导入基因影响GFP裸小鼠脾脏形态及其功能的机制尚需进一步研究。

另外，本科室已有研究人员就GFP裸小鼠的体液免疫以及细胞免疫例如T细胞活性及数量、B细胞活性以及NK细胞活性正在进行进一步的研究与探讨。

4　GFP裸小鼠在生物学研究中应用

4.1肿瘤学中应用

GFP裸小鼠在国外的应用广泛，遍布于肿瘤学、基因学等多个生物科学领域，如RFP标记肿瘤细胞接种到绿色荧光裸小鼠体内后, 在荧光显微镜或荧光成像系统下可以很清楚区分动物正常组织细胞及肿瘤细胞，能方便地在动物活体内观察肿瘤的生长、代谢、转移、凋亡情况［34］, 也能观察肿瘤动物模型在各种治疗（药物、化疗、放疗、生物治疗等）后的恢复情况［35］。在研究人类肿瘤的发病机制、侵袭与转移过程和治疗措施中占据重要地位，而带荧光标记的裸小鼠能更好模拟及观察肿瘤侵袭与转移的微环境［8］。GFP裸小鼠因无毛发遮掩，成像更为简单，有望取代手术解剖或切割皮肤的方法来观察肿瘤组织［36］。另外，GFP裸小鼠模型有助于鉴定肿瘤组织中细胞生物学特性，也提供了研究肿瘤血管生成中细胞间融合作用的简易工具,以GFP/RFP在同一个多核巨细胞中出现的示踪证据直接证实：肿瘤细胞和正常宿主细胞融合后的细胞更加具有转移能力、侵袭性、耐药性、异倍体性以及恶性基因水平转移等［37］。

近年GFP裸小鼠在国内肿瘤学方面的应用研究也逐渐增多。绿色荧光裸小鼠的建立和应用中，将RFP-A549细胞皮下接种于GFP转基因小鼠体内，结合分子影像技术手段，利用双色荧光成像系统区分癌细胞和宿主动物［38］。GFP裸小鼠为进一步研究癌细胞和宿主动物之间的关系提供了有力的工具动物，是活体荧光影像研究的重要实验动物，符合实验动物学“3R”原则。同样, 代兴亮等［39］将转染RFP基因的SU3、U87-MG细胞和用亲脂性的碳青染料染色的c6胶质瘤细胞，接种于GFP近交系裸小鼠脑内，建立RFP/GFP双色荧光示踪的肿瘤模型，结果表明，移植瘤组织重构是在侵袭于脑实质、脑室、脑血管的肿瘤细胞诱导或宿主细胞融合后发生的。

与普通裸小鼠相比，GFP裸小鼠除了有明显的活体观察和体内示踪方便的优势之外，在成瘤率和肿瘤组织特性方面也有一定优势。胡文娟等［40］比较GFP裸小鼠结直肠癌肿瘤模型和普通裸小鼠模型的肿瘤形态学、生物学特性以及病理学之间的差异，结果表明，GFP裸小鼠结直肠癌肿瘤模型的成瘤时间较短（3～5 d），肿瘤瘤体积较大，且在显微镜下，病理切片上观察到肿瘤细胞生长活跃，大小较为均匀，部分区域可见腺腔形成。

4.2其他应用

Hu等［41］从GFP裸小鼠体内分离培养内皮细胞（endothelial cell, EC）。在体外研究中，检测红细胞生成素（EPO）对EC扩增和凋亡的影响；在体内研究中，诱导普通小鼠制作急性肺损伤模型，随机分为两组，一组静脉注射从GFP裸小鼠体内分离的EC进行处理，另一组不进行处理作为对照组，检测各组肺脏内皮修复、肺脏毛细血管通透性、急性肺炎和肺脏血管新生状况，结果显示EPO对内皮祖细胞（EPC）有明显的抗凋亡和扩增作用，EPC可降低急性肺损伤程度，且与EPO联合给药对EPC会有保护效应，EPO对EPC的作用可能是由磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB, 也称Akt）（PI3K/Akt） 信号通路介导的。

张俊华等［42］在研究间充质干细胞治疗实验性自身免疫性脑脊髓的疗效和免疫调节机制的过程中，用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白和弗氏完全佐剂诱导建立小鼠自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，随机分为骨髓间充质（MSC）细胞治疗组和EAE组。MSC组尾静脉注射分离纯化GFP裸小鼠MSC细胞，EAE组尾静脉注射PBS，采用临床评分和脊髓组织切片评估小鼠的发病情况，结果表明，MSC移植对小鼠EAE疗效显著。

Zhao 等［43］应用GFP裸小鼠进行细菌靶向治疗肿瘤的体内研究。RFP标记前列腺癌细胞PC-3，并于体外将鼠伤寒沙门氏菌感染PC-3细胞； 再将细胞接种于GFP裸小鼠，活体成像，研究结果显示，肿瘤接种15 d，肝脏、肺脏、脾脏和肾脏中没有检测到鼠伤寒沙门氏菌，但PC-3肿瘤停止生长，并在肿瘤中检测到鼠伤寒沙门氏菌，为肿瘤治疗提供了另一条有效途径。Hose等［44］将肾母细胞瘤基因WT1导入GFP裸小鼠， 揭示WT1在正常造血和患有白血病个体造血过程中动态调控规律，指出白血病造血干细胞中表达WT1，而正常造血干细胞中不表达WT1，这将会白血病的一个特异性靶向治疗方向。

5　展望

从GFP裸小鼠的培育到应用，已有20年，科研工作者对其免疫学特点及其生理生化特征都做了一定的研究。但是，就目前相关文献报道而言，对该小鼠体液免疫特性研究较少，对细胞免疫研究也不完善，例如T细胞数量及功能、B细胞功能和NK细胞功能均未有明确报道，有待进一步探讨。深入了解GFP裸小鼠的免疫学特性，有助于扩大其应用范围，从而为生物科学研究提供新的动物模型。另外，GFP/RFP双色荧光示踪的肿瘤模型因其在肿瘤发生发展过程中分别独特地示踪肿瘤细胞与宿主组织细胞的双重关系，对研究肿瘤微生态环境［45］、肿瘤细胞社会成员关系［46］等目前热点问题具有重要意义。

本文作者尝试将GFP裸小鼠应用于肿瘤模型双色示踪研究，但需要克服诸多难点，如在建立（RFP）标记的肺腺癌A549皮下接种GFP裸小鼠的肿瘤模型和花菁染料活体示踪GFP裸小鼠肿瘤模型的建立和研究中，活体双色荧光成像时，需要光谱范围广，穿透力强的荧光显微镜。利用GFP裸小鼠的组织以及血管都能表达强烈GFP荧光的优势，在研究肿瘤组织血管新生的过程中具有重要价值，但需结合制作冰冻切片、免疫荧光以及共聚焦成像等一系列等分子研究方法。

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Progress on Development and Application of BALB/c Nude Mouse with GFP

FANG Tian, YUN Shi-feng
（Department of Comparative Medicine， Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command， Nanjing 21002， China）

It reported here that the development and application of the transgenic green fluorescent protein （GFP） nude mouse with ubiquitous GFP expression. BALB/c nude mouse with GFP were bred for cancer research initially, in which were deficient in T lymphocytes. In the last decades, researchers had studied vastly and deeply the biological characteristics and application of BALB/c nude mouse with GFP. The application of GFP nude mouse model should greatly expandedour knowledge inscience research.

Green fluorescent protein （GFP）； Nude mouse； Immunologic characteristics； Tumor models

Q95-33

A

1674-5817（2016）02-0152-05

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.01.016

2015-10-09

南京军区南京总医院院课题（2013001）

方天（1984-）, 女, 硕士, 技师。E-mail： Fangtianlove@126.com

恽时锋（1965-）, 男, 博士, 主任技师, 教授, 硕士研究生导师, 从事医学实验动物学工作。E-mail： yunshifeng1@163.com