固定化酵母在酿造技术及燃料乙醇领域中的应用

窦冰然，郭会明，朱曼利，李伟，洪厚胜,3*

1(南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏 南京，211816) 2(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京，211816) 3(南京汇科生物工程设备有限公司，江苏 南京，210009)



固定化酵母在酿造技术及燃料乙醇领域中的应用

窦冰然1，郭会明1，朱曼利1，李伟2，洪厚胜2,3*

1(南京工业大学 化学与分子工程学院，江苏 南京，211816) 2(南京工业大学 生物与制药工程学院，江苏 南京，211816) 3(南京汇科生物工程设备有限公司，江苏 南京，210009)

细胞固定化技术从20世纪70 年代开始快速发展，现已在在发酵工业、生物能源、化学分析、医药工业等多个领域得到了广泛的运用，充分显示了这种技术的优越性。同时，固定化细胞生长速度快、反应快、不易染菌、节约成本、产物易于分离，越来越多的应用于发酵领域中。凭借以上优点，固定化酵母也被越来越多的研究者深度研究，不同的固定化方法和固定化载体对酵母固定化的效果有很大影响。文章综述了传统的酵母固定化方法和新型固定化方法，并介绍了固定化酵母在酿造技术和燃料乙醇领域的应用概况，展望了固定化酵母的应用前景和研究方向。

固定化技术；酵母；燃料乙醇；固定化反应器

固定化技术运用在细胞方面多用于在酶和酵母，酵母早已在发酵行业拥有广泛的应用基础，随着固定化技术的不断推广，固定化酵母开始替代游离酵母在酒精发酵方面使用，主要分为酿酒技术和燃料乙醇两个应用方面。虽然，酵母固定化技术也存在着传质限制、固定介质抑制固定化酵母生长和其代谢等缺陷的问题，但是站在长远发展的角度来看，应用酵母固定化技术在发酵行业依然发展潜力巨大。

1 固定化酵母概述

1.1 细胞固定化技术

细胞固定化技术是在20世纪70年代发展起来的一门新兴技术，是指用物理或者化学的方法将具有一定生理活性的生物细胞，如动植物细胞、微生物细胞等固定于载体上，用作固体生物催化剂，并使其在连续反应时中能够保持稳定生长并且繁殖能力维持旺盛，并且可以反复使用的一种固定化方法[1]。固定化技术首先应用于各种固定化酶，随后应用于固定化完整细胞。

相比于游离态细胞，细胞因为受到载体的固定化，有利于固定后的细胞与产物之间的分离，而且研究发现，固定化之后的细胞，其反应速率得到了显著提高。因此这项技术在制药行业、食品工业、环保行业与传统发酵工业[2]中都得到了广泛的推广使用。根据固定化后的细胞是否增殖还可以分为静止细胞、饥饿细胞和增殖细胞等固定化技术，其中，固定化增殖细胞因为固定化后的细胞可以不断繁殖更新且更加稳定的特点，在发酵工业中最有发展前途。

1.2 固定化酵母的优越性

固定化酵母指将酵母活细胞高度密集分布在载体上，并可以不断地增殖，以此得到高浓度生物催化剂。使用固定化的酵母进行发酵与使用传统的游离态酵母进行发酵方法相比具备以下3个优点：

(1)酵母经固定化后细胞的密度得到提高，增殖速度更快，缩短了发酵周期，同时稳定性较高；

(2)固定化酵母可以重复利用，使用寿命可达两个月，相比于游离酵母，培养过程也更加简单,同时减少了营养基质的流失，有利于连续生产，有效降低了生产成本；

(3)设备要求简单，易于操作，投资费用低，适用于大规模的工业化生产。

2 细胞固定化方法

2.1 包埋法

包埋法是指在无菌的条件下，将细胞与凝胶溶液相混合，再经过一定处理，通过物理方法形成直径1～4 mm的胶粒，使酵母固定化。利用这种方法得到的固定化酵母和载体之间没有束缚，经过固定化之后，细胞依然可以保持较高活力[3]，可以在短时间之内提高反应速率和细胞浓度，且操作简便，反应条件温和，对于细胞的活性影响较小，所以是固定化酵母的常用手段。常规的凝胶载体包括海藻酸钠、聚乙烯醇(PVA)、卡拉胶、聚丙烯酞胺(ACAM)、琼脂、醋酸纤维等[4]。近年来，也有将不同凝胶载体组合使用制成复合固定化载体进行固定、发酵的实验方法。周宁等[5]用海藻酸钠-琼脂作为固定化载体，固定化啤酒酵母，通过优化载体固定化条件和固定化啤酒酵母的发酵条件，发酵速度提高为0.735 °p/h，且复合固定化载体相比于单一的海藻酸钠载体或者琼脂载体更适合酵母增殖。高亚飞等[6]通过将一定量的聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠溶液混合作为固定化载体，包埋糖蜜酒精酵母，通过正交优化确定以聚乙烯醇-海藻酸钙为固定化载体的糖蜜酒精酵母的最优发酵条件，优化后的酒精浓度为13.11%vol。巫小丹等[7]通过实验对比了SA-PVA-SiO2载体固定化酿酒酵母与游离酿酒酵母的乙醇发酵能力，并通过电镜扫描对固定化酿酒酵母的包埋微生态环境进行分析，结果显示固定化小球的内部条件十分有利于酵母细胞生产乙醇所需要的厌氧发酵，从而充分证明了 以SA-PVA-SiO2为载体的固定化酿酒酵母对于乙醇发酵的优越性。

2.2 吸附法

吸附法也可以叫做载体结合法，这种方法具有经济且制备方法简单的特点。吸附法的原理是通过静电吸引作用或者利用载体对酵母细胞的亲和性将酵母细胞吸附在固体载体上的一种固定化方式。此方法的优点在于细胞和载体之间发生的是物理变化，而且操作简单、活性损失小、固定化载体可以反复使用、固定化条件温和，但是由于制得的固定化酵母吸附能力不强，容易造成细胞脱落，所以受环境影响大，稳定性差[8]。对于吸附法固定酵母细胞，通常选用内部多孔、表面积大、性质比较稳定、价格低廉、高强度、性质性能良好的材料作为载体。常用的载体包括活性炭、硅藻土、碳酸钙、高岭土、石英砂、陶瓷、木屑、硅胶、多孔玻璃等[9]。

当使用单一的包埋法或吸附法对酵母细胞进行固定化时，发酵产生的结果也会有所不同。朱元华[10]以山毛榉木片和海藻酸钠固定化酵母，利用气相色谱法对比两种固定化方法对啤酒风味物质成分的影响，结果表明，当选用不同的固定化载体时，对啤酒中风味物质成分的形成也有所不同，其中海藻酸钠载体固定化酵母的牢固程度最好，且啤酒中醇类物质含量较高，适于醇厚型啤酒的酿造；利用山毛榉木载体固定化的酵母细胞酿造的啤酒生成的酯类物质较多，适于淡爽型啤酒发酵。近年来，也有研究人员将不同的固定化方法结合使用的报道，陶中书等[11]利用海藻酸钠和山毛榉木片来吸附-包埋复合固定化酵母用于啤酒连续发酵，通过对比试验发现，复合固定化酵母数量最多，生物载荷量高达2.17×1010个/g，并且牢固程度也最优。

2.3 交联法

交联法是利用双功能或者多功能试剂和细胞表面的反应基团反应，使细胞固定，交联法的不需要载体，可以得到较高的细胞浓度，并且结合力高，稳定性较好，经得起温度、pH的剧烈变化，但是由于反应激烈，对细胞的活性会产生影响，所选试剂会毒害活细胞，机械强度低，无法再生，因而实际生产应用不多，通常与其他固定化方法结合使用[12]。常用的试剂有甲苯二异氰酸酯、戊二醛、双偶氮联苯等。此方法多用于固定化酶的研究，用于酵母的固定化则报道不多。

2.4 絮凝法

絮凝法是利用自身具有的自絮凝能力的某些微生物细胞对细胞进行固定化的方式，是一种不需要添加固定化载体的细胞固定化方法。VERSTREPEN[13]等认为絮凝机制分可分为2种:一种是细胞表面的凝集素和邻近细胞的细胞表面甘露糖结合引起的絮凝；另一种是细胞表面的多肽相互吸引或细胞表面疏水相互作用力的相互作用而引起的絮凝。絮凝法的优点在于固定化过程简单、细胞代谢能力高、代谢抑制和传质限制小、细胞可以长期使用等优点。但是由于细胞颗粒刚性比较差，所以存在容易发生变形，不耐剪切，对发酵所需原料要求高等缺点。对于某些不可絮凝或者絮凝能力较弱的酵母菌,有时可通过外源添加助凝剂或交联剂的方法来促进絮凝,此法即为交联法。白凤武[14]以酵母自身絮凝形成颗粒固定化细胞，建立了有效容积0.5 m3的悬浮床生物反应器用于酒精连续发酵，发酵过程顺利完成。

2.5 膜隔离法

膜隔离法的作用机理是利用半透膜将细胞限制在一定的空间内，底物和产物可以通过半透膜，但是微生物细胞则不能通过，从而达到细胞固定化的目的的一种方法，常用的半透膜包括超滤膜、反渗透膜、渗析膜、中空纤维膜等[15]。膜隔离法的特点是可以通过控制膜孔径选择性的控制底物与产物的扩散、基质可以充分接触微生物细胞，缺点是传质受到限制、膜容易发生堵塞、成本也相对较高[16]。

2.6 新型固定化方法

相比于以上传统固定化方法，近年来出现了许多新型固定化方法。李贵银[17]研究了利用制备的磁性纳米壳聚糖微球作为载体对酵母细胞进行固定化，实验发现在催化反应时，磁性固定化细胞的活性优于游离细胞,并且有一定的储存稳定性。周勖[18]利用纳米氧化锌固定化酿酒酵母，结果表明在催化反应中使用含有1×10-2g/mL及以上浓度的纳米氧化锌固定细胞,能够使反应液及分离后的反应上清液具有针对原核生物较好的抗菌能力。董江清[19]利用新鲜甘蔗去皮后切成的约1 cm3的甘蔗块固定化酵母细胞，研究发现使用这种新型固定化材料固定化的酵母与游离酵母发酵相比更具有优越性，酵母经过固定化后发酵36 h时与发酵相同时间的游离酵母相比发酵速率更高。

3 酵母固定化在酿造技术中的应用

固定化酵母能够提高酵母对于抑制发酵性产物和发酵环境的耐受力。由于酵母细胞固定后载体表面和载体内酵母细胞浓度得到提高,形成了浓度优势,从而确保酵母不易染菌,同时有效的减少了有害物质对酵母产生的抑制作用。

固定化酵母用于酿酒技术相比于游离酵母，可以有效改善风味，使口感更加柔和，同时由于固定化酵母发酵过程中可以有效减少菌体损失，可以用于酒精连续发酵中，发酵效率有效提高。薄艳秋等[20]将加有 SiO2和 Al2O3的 PVA-海藻酸钠载体进行强化，用于固定蓝莓酵母，强化后固定化酵母发酵的蓝莓酒香味浓郁、持久，口味柔滑，相比之下游离酵母发酵的蓝莓酒酒体单薄，因酸度太高，苦涩感较重。潘嫣丽等[21]在加入0.01%的以海藻酸钠作为载体固定化酵母，在25 ℃条件下发酵8 d，得到了酒精含量在12.8%vol的雪莲果-西番莲复合果酒，该产品色泽淡黄自然、具体和谐的果香和酒香、入口清爽。刘凯[22]利用固定化酵母进行啤酒的连续发酵，生产出的啤酒的主要理化指标与传统间歇式发酵所生产出的啤酒接近，对成品啤酒的品质与风味没有产生不良影响。

4 酵母固定化在制备燃料乙醇中的应用

随着能源危机和环境污染等问题日益严重,许多国家开始积极研发石油替代资源。燃料乙醇作为一种清洁的可再生能源,因而得到了各方广泛关注。然而,菌体抗胁迫能力差、底物转化率低以及生产成本高等问题制约了燃料乙醇产业的发展。因此,实验人员围绕这些问题开展了大量的研究。众多学者将酵母细胞固定化技术应用于燃料乙醇的研究与制备中[23-24],并取得了良好的效果。

固定化酵母发酵对酵母细胞生理特性和代谢活力等方面会产生影响,如细胞的形态、胞内的渗透压、pH和细胞膜的通透性[25]等,导致酵母细胞中原本的生理生化平衡环境被破坏, 并导致胞内关键酶活性产生波动, 出现相容性溶质和细胞周期发生变化等。GLAZZO等[26]发现相比于游离酵母，固定化酵母的乙醇生成速率更快, 且前者胞内的磷酸果糖激酶与ATPase活性高于前者。DORAN等[27]发现固定化酵母的胞内储存性多糖含量更高,同时,胞内DNA、RNA和蛋白质的种类和含量同样存在着明显差别。

目前,在燃料乙醇的研究与制备中, 连续发酵已经逐步取代了分批发酵工艺,而酵母细胞固定化技术可以明显提升连续发酵生产乙醇的效果,所以在连续发酵的同时加入酵母细胞固定化技术进行燃料乙醇的生产一贯是该领域的研究热点之一。固定化酵母在燃料乙醇发酵生产上已经得到了广泛的应用。李文[28]利用海藻酸钠包埋酵母以小麦秸秆作为发酵底物生产燃料乙醇，发酵120 h后，乙醇浓度达28.94 g/L,乙醇产率为76%，并且对固定化酵母进行了循环利用。王治业等[29]利用固定化酵母直接发酵甜菜汁制备燃料乙醇，固定化酵母进行甜菜酒精发酵比游离酵母酒精平均值提高了2.86%。在发酵过程中不进行灭菌处理的情况下连续发酵9个批次，产酒精性保持稳定。邬全喜[30]利用以海藻酸钠为载体的固定化酵母生产樱桃果酒，研究游离态酵母后期发酵速度减慢，而且会产生底物抑制，固定化酵母最终酒精度更高，并且菌体回收方便，在工业化生产上具有突出的优势。

5 固定化反应器

生物反应器的选择与设计是利用固定化酵母连续生产燃料乙醇的关键之一。目前,得到广泛应用的生物反应器主要分为五类[31]:流化床反应器，气升式反应器，填充床反应器，膜式反应器和搅拌反应器。

5.1 气升式反应器

使用气升式反应器固定化细胞的生长速率较高，混合度相对较好，而且对细胞存在良好的剪切保护，不易染菌，反应器结构简单，能耗低。缺点在于不利于生产放大,费用偏高[32]。

5.2 流化床反应器

流化床反应器的优点在于方便连续操作，剪切力小，传质传热效果好并且染菌风险低[33]。但是,这种反应器需要固定化介质的密度和发酵液的密度相近,否则会产生能耗增加、发酵周期发生改变、固定化酵母分布不均匀甚至洗出等一系列问题。

5.3 填充床反应器

填充床反应器的特点是返混小，结构简单并且载体机械磨损小等。此类反应器的缺点是操作过程中固体催化剂不能更换，易形成气沟或风沟以及传质，传热效果较差等。此外,用于填充床反应器的固定化介质应当具有良好的不可压缩性。

5.4 膜式反应器

膜式反应器催化效率高,易于放大并且有利于对反应过程的控制,下游相应的处理简单。然而在发酵时，产生的浓差极化以及膜污染等问题会导致膜式反应器的传质速率与生产能力迅速降低，膜孔发生堵塞、膜厚的增加使膜的结构和形态产生不利变化[34]，因为这些原因所以反应器所使用的膜要求频繁清洗与更换。

5.5 搅拌反应器

搅拌反应器配备有搅拌装置,有良好的传质、传热性能。但是搅拌产生的剪切力较大,所以要求固定化介质具有一定的机械强度,否则会造成固定化介质机械磨损,并导致酵母细胞外泄。

6 结语

利用固定化酵母进行发酵，相比于传统游离酵母具有更加显著的优点，同时也可以提高发酵速率，未来固定化酵母的研究方向将主要放在研究新型固定化载体，利用纳米技术，磁性聚合物微球等将原有固定化方法进行改进，开发廉价，更利于反复使用，对酵母或细胞毒相对性小的固定化载体。随着生物技术在国民经济中的地位不断提高，以及固定化技术的不断发展完善和成熟，固定化酵母必然会在发酵领域及其他相关领域发挥越来越重要的作用。

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The application of immobilized yeast in brewing technology and in fuel ethanol

DOU Bing-ran1,GUO Hui-ming1,ZHU Man-li1,LI Wei2,HONG Hou-sheng2,3*

1(Nanjing Tech University, College of Chemistry and molecular Engineering, Nanjing 211816,China) 2(Nanjing University of Technology, College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing 211816,China) 3(Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co., Ltd.,Nanjing 210009,China)

Immobilized cell technology is a biological technology developed rapidly after the 1970s and now widely used in many fields, including fermentation industry, food industry, chemical analysis and pharmaceutical industry, fully displaying its superiority. Due to the properties of fast growth, quick reaction, anti-pollution ability , cost effective, and convenience for separation, immobilized cells are more and more applied in the field of food and fermentation. With the above advantages, the immobilized yeast was also studied by more and more researchers. Different immobilization methods and immobilized carrier had great influence on the effect of immobilized yeast. The traditional yeast immobilization methods and new immobilization methods were reviewed in this paper. The application situation of immobilized yeast in brewing technology and the field of fuel ethanol were introduced. The application prospect and the research direction of the immobilized yeast were also forecasted in this paper.

immobilization; yeast; ethanol; immobilized bioreactor

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201610036

硕士研究生(洪厚胜教授为通讯作者,E-mail:hhs@njtech.edu.cn)。

国家高技术研究发展计划(863计划)- 生物过程关键技术及装备开发 (No. 2012AA021201)

2016-04-12，改回日期：2016-05-19