神经生长因子诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效果观察及相关蛋白网络分析

苏立宁，宋小青，魏会平

(河北北方学院基础医学院，河北张家口075000)



神经生长因子诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的效果观察及相关蛋白网络分析

苏立宁，宋小青，魏会平

(河北北方学院基础医学院，河北张家口075000)

目的 观察神经生长因子(NGF)诱导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞分化的效果，并分析相关蛋白网络。方法 将4周龄健康SD大鼠4只，脱臼处死取股骨分离BMSCs并传代。取第5代 BMSCs制备细胞爬片，分为观察组和对照组两组，观察组加入3% DMSO、60 ng/mL NGF 、DMEM/F12预诱导液预诱导2 h，预诱导完成后加入100 ng/mL NGF、DMEM/F12诱导液诱导48 h。对照组不加任何药物。诱导完成后倒置显微镜观察两组细胞形态变化，用免疫组化法检测两组BMSCs中的神经元特异性烯醇酶(NSE)蛋白，用实时荧光定量PCR法检测BMSCs中的NSE mRNA。采用生物信息学软件STRING10.0分析NGF在诱导BMSCs向神经细胞分化中参与的蛋白网络，并对网络系统中编码蛋白的基因进行功能富集分析。结果 镜下可见观察组细胞体积增大，细胞核固缩，核质比降低，细长突起明显，部分细胞间以网络状连接。对照组细胞密度较均匀，形态以长梭形为主。诱导完成第1、2、4 天，观察组NSE mRNA相对表达量分别为1.34±0.06、2.23±0.23、1.56±0.09，两组比较，P均<0.05。观察组诱导完成第1、2 天时NSE蛋白阳性细胞数分别为(35±8)、(133±6)个，对照组未检测到NSE蛋白阳性细胞，两组比较，P均<0.05。以NGF为种子节点得到与NGF直接发生作用的105个蛋白节点，共3个中心节点，分别为NGF、神经生长因子受体和泛素C。对网络中的各个节点进行GO功能富集分析，结果富集在神经分化、神经发育及调控神经凋亡等生物学过程。NGF与Ras蛋白特定鸟嘌呤核苷酸释放因子1、 脑衍生神经营养因子、 生长抑制蛋白、 NGF、NGFR、神经营养受体酪氨酸激酶1、神经营养受体酪氨酸激酶2、 神经营养因子3、 极微小蛋白激酶C、GTP结合蛋白RAC、核糖体蛋白S27A、 信号传导子及转录激活子3、 酪氨酸羟化酶、 泛素A-52、泛素B和UBC等蛋白相互作用调控神经分化过程。模块分析结果显示中心节点NGF、NGFR和UBC在模块1中发挥核心的作用。结果 NGF可诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化。以NGF为种子节点，筛选到105个与NGF直接发生互作的蛋白节点。NGF、NGFR和UBC在NGF诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化的蛋白网络中发挥核心作用。

骨髓间充质干细胞；神经生长因子；诱导分化；蛋白互作用；动物实验

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是一种多能干细胞，取材方便。研究发现，BMSCs 可向多种细胞及神经样细胞分化[1～4]，但BMSCs的分化机制复杂。神经生长因子(NGF)高表达于中枢神经系统，具有调控神经元分化、轴突生长、抑制神经细胞凋亡等作用[5～7]。NGF可诱导BMSCs分化为胆碱神经细胞[8]，与功能受体TrkA结合，通过非Ras依赖途径调控神经细胞的分化[9]。目前没有可诱导BMSCs分化为稳定存活的神经细胞的方法。2015年3～8月，我们采用NGF诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化，并分析相关蛋白网络。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药物及仪器 4周龄健康SD雄性大鼠4只，由河北北方学院实验动物中心提供，大鼠BMSCs的分离、培养及鉴定在河北北方学院实验中心细胞室完成。饲养条件符合各等级动物的卫生质量要求。

DMEM 、DMEM/F-12 培养基购自上海立菲生物技术有限公司；胎牛血清(FBS) 购自美国Life Technology 公司；NGF 购自美国GenScript公司；RNA (TaKaRa)提取试剂盒购自大连宝生物公司；兔抗巢蛋白(nestin)、兔抗神经元特异性烯醇化酶(NSE)购自北京博奥森生物技术有限公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ荧光染料购自大连宝生物公司。

1.2 NGF诱导大鼠BMSCs向神经细胞分化的效果观察

1.2.1 大鼠BMSCs的分离、培养及鉴定 取4只大鼠，脱臼处死，无菌条件下分离股骨，D-Hanks液冲洗多余血液，含1%的双抗(青、链霉素)+10%FBS的DMEM培养液冲洗骨髓腔，将所得细胞悬液，置于37 ℃、5 %CO2饱和湿度的培养箱中培养，待细胞细胞密度80 %～90%时，传代。传代至第5代，倒置显微镜下鉴定分离细胞。镜下可见细胞密度均匀，以长梭形为主，流式细胞仪检测BMSCs阳性标记物CD29、CD90表达率分别为99.8%、88.6%，CD34、CD45的表达率分别为1.8%、23.3%，证明分离细胞为BMSCs。

1.2.2 大鼠BMSCs诱导分化 取传代第5代的BMSCs，以4×105/mL细胞密度制备细胞爬片，待细胞贴壁生长，将细胞分为观察组和对照组两组，观察组加入3% DMSO、60 ng/mL NGF 、DMEM/F12预诱导液预诱导2 h。和100 ng/mL NGF +DMEM/F12诱导液诱导49 h。对照组不加任何药物，培养48 h后备用。

1.2.3 分化细胞鉴定 ①细胞形态观察：采用倒置显微镜观察两组细胞形态。②神经元特异性烯醇酶(NSE)mRNA检测：采用实时荧光定量PCR法检测观察组诱导完成第1、2、4 天和对照组任一时点NSE mRNA。根据GenBank公布的基因序列设计引物，由华大合成。NSE上游引物3′-TCGCCACATTGCTCAACT-5′，下游引物为3′-AACTCAGAGGCAGCCACATC-5′。反应条件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火31 s，40个循环，72 ℃延伸10 min。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。③NSE蛋白检测：采用免疫细胞组化法检测观察组诱导完成第1、2天和对照组任一时点NSE蛋白。着色的为阳性细胞，随机选取3张玻片观察，每张玻片选取5个视野，计数每个视野的阳性细胞数，以5个视野的平均阳性细胞数代表各组阳性细胞数。

1.3 NGF诱导BMSCs向神经细胞分化的蛋白网络分析 采用生物信息学软件STRING10.0[10]对NGF诱导BMSCs向神经细胞分化的蛋白网络进行分析，选取交互作用评分大于0.9的互作关系构建蛋白互作网络。用生物图表可视化工具Cytoscape3.4.0软件[11]对各节点的度和中心度进行计算，筛选该蛋白互作网络中的中心节点(中心度>0.05，度高于均值)。用 Cytoscape 3.4.0软件对蛋白质相互作用网络进行功能模块分析，筛选标准为minimum size=6, minimum density=0.05，P<0.05。 用DAVID软件[12]对网络中的节点进行功能富集分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。计量资料采用表示，组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1NGF诱导大鼠BMSCs诱导分化的细胞鉴定结果 镜下可见观察组细胞体积增大，细胞核固缩，核质比降低，细长突起明显，部分细胞间以网络状连接。诱导完成第1、2、4 天，与对照组比较，观察组NSEmRNA相对表达量分别为1.34±0.06、2.23±0.23、1.56±0.09，P均<0.05。观察组诱导完成第1、2 天NSE蛋白阳性细胞数分别为(35±8)、(133±6)个，对照组未检测到NSE蛋白，两组比较，P均<0.05。

2.2NGF诱导BMSCs向神经细胞分化的蛋白网络 以NGF为种子节点，利用STRING10.0 数据库分析与NGF直接发生作用的蛋白节点，共得到105个蛋白节点。用Cytoscape3.4.0可视化软件计算各节点的度和中心度后得到3个中心节点，分别为NGF、神经生长因子受体(NGFR)和泛素C(UBC)。NGF与Ras蛋白特定鸟嘌呤核苷酸释放因子1(RASGRF1)、 脑衍生神经营养因子(BDNF)、 生长抑制蛋白(NDN)、NGF、NGFR、神经营养受体酪氨酸激酶1(NTRK1)、神经营养受体酪氨酸激酶2(NTRK2)、 神经营养因子3(NTF3)、 极微小蛋白激酶C(PRKCI)、GTP结合蛋白RAC、核糖体蛋白S27A(RPS27A)、 信号传导子及转录激活子3(STAT3)、 酪氨酸羟化酶(TH)、 泛素A52(UBA52)、泛素B(UBB)和UBC等蛋白相互作用调控神经分化过程。NGF与RASGRF1、BDNF、NDN、NGF、NGFR、NTRK2、NTF3、PRKCI、RAC1、RPS27A、TH、UBA52、UBB、UBC共同调控神经发育，与BDNF、成对碱性氨基酸蛋白酶(FURIN)、NTRK1、 前蛋白转化酶枯草溶菌素6(PCSK6)、小G蛋白RHOA、原癌基因(HRAS)调控神经元凋亡。模块分析结果显示中心节点NGF、NGFR和UBC在模块1中发挥核心的作用。

3 讨论

BMSCs的分化受基因和蛋白的影响，而这些基因或蛋白之间的相互作用在调控BMSCs分化中发挥着至关重要的作用。在某种程度上可以说，细胞分化是蛋白质或基因在一定条件下相互作用的结果，若这些相互作用网络被破坏或稳定性丢失，会严重影响细胞的分化功能。因此本研究以NGF单因子诱导BMSCs向神经元细胞的分化，同时应用蛋白质互作网络分析在神经分化或其发生发展过程中与NGF共同作用的网络因子。

本研究验证了NGF可以促进BMSCs向神经细胞定向分化，并稳定表达NSE等标志物，这与以往研究[5]结果一致。应用STRING数据库和生物信息软件分析，得到105个与NGF互作的蛋白因子，通过分析得知NGF、NGFR和UBC三个蛋白因子可能作为网络中的核心蛋白发挥重要的作用。通过GO功能富集分析，筛选了与神经分化、神经发育及神经凋亡相关的GO组。NGF与16个蛋白共同调控神经分化，模块功能分析将网络中的蛋白聚集在两大模块，结果显示中心节点NGF、NGFR和UBC在模块1中发挥核心的作用，进一步验证了核心蛋白的作用。而这些潜在的互作关系，或许是生物科学工作者要进一步研究的方向。这对于解析细胞内蛋白间相互作用关系以及相关信号传导机制具有极其重要的意义。已有研究表明，NGF通过抑制损伤脊髓组织中兴奋性氨基酸的释放、周围的炎症反应和抑制神经元细胞外钙离子内流等一系列反应抑制神经元细胞的凋亡[12～14]；RASGRF1的表达可以促进NGF等神经营养因子诱导的神经轴突的生长[13]；与Ntrk1 和NGFR受体结合启动一系列生物化学反应，进而调控交感神经和感官神经发育中神经细胞的增殖、分化及存活[14～16]；激活神经营养反应，预防或延缓阿尔茨海默患者胆碱神经元减少[17]。NTRK1是一种神经生长因子高亲和力受体，与NGF结合通过调控神经细胞的增殖、分化及收缩维持中枢及周围神经的发育和成熟，且发现该受体与NTF3结合支持轴突的延伸，却不能维持神经细胞的存活[18]。后续实验进一步证明Ntrk1可编码一种酪氨酸激酶受体TRKA蛋白，该受体与NGF作用，调控神经元的存活、修复等活动[19]。NGF和BDNF各自通过其特异受体发挥作用，在促使神经元修复、轴突再生、调节突触可塑性和神经递质等神经系统的活动方面发挥了重要作用[9]。

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河北北方学院重大项目(120177)；河北省高等学校科学技术研究指导项目(Z2015047)。

魏会平(E-mail: whp123456@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.39.010

R738.1

A

1002-266X(2016)39-0033-03

2015-11-10)