山东省某养鸡场禽流感发病情况的调查

孙丽丽

（山东省荣成市荫子畜牧兽医站，山东荣成 264300）

山东省某养鸡场禽流感发病情况的调查

孙丽丽

（山东省荣成市荫子畜牧兽医站，山东荣成 264300）

禽流感（avinaninuenza，AI）是由A型流感病毒引起的一种禽类（家禽和野鸟）的传染性疾病。在各种禽类中的流行有多种表现形式，可见亚临诊症状、轻度上呼吸道感染以及急性致死性等。本实验调查了实习养鸡场中鸡群禽流感免疫效果和发病状况，为禽流感的预防和治疗提供一定的指导作用。

A型流感病毒；预防；治疗

1 材料与方法

1.1 试验材料

禽流感H5标准毒株、阴性血清和阳性血清均有哈尔滨兽医研究所生产；禽流感诊断试剂盒由武汉科前动物生物制品有限公司生产；棉拭子，96孔微量反应板，琼脂糖均有实习公司提供。

1.2 试剂的制备

1%鸡红细胞悬浮液制备：采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血清与等体积的阿氏液混合，用PH7.2 0.01mol/LPBS洗涤3～5次，每次均以1000转/min离心10min，将最后一次离心得到的红细胞，用PBS配成体积分数为1%红细胞悬浮液，4℃保存备用。

pH7.2 0.01mol/LPBS的制备：（1）配置25×PB：称取2.71g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至1000ml；（2）配置1×PBS：量取40mol25×PB，加入加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000ml，用氢氧化钠调至PH7.2，灭菌或过滤。PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。

阿氏液：（Alsevers）制备：葡萄糖2.05g，柠檬酸0.055g，氯化钠0.12g，加蒸馏水至100ml，散热溶解后调至PH6.1，69KPa高压灭菌15min，4℃保存备用。

琼脂板的制备：称取进口琼脂1.0g加入100mlPH7.2、0.01mol/ LPBS中，在水浴锅加热充分融化，加入8.0g氯化钠，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml，冷却至45℃～50℃时，倒入平皿制成3mm厚的琼脂板。

1.3 样品采集与处理

分别从2个养殖场采取20只40日龄鸡的血样和泄殖腔拭子及喉头拭子，同一场分为一组，记为组一、组二，分别为每组中各只鸡编号，记为1、2、3至20。血液离心取血清备用；喉头拭子和泄殖腔拭子用无菌棉拭子于禽类喉头或泄殖腔中蘸取渗出液，然后浸泡于1ml样品处理液中，剧烈震荡1min后，挤出棉拭子中的液体，弃棉拭子，液体冻融3次后于36～38℃作用15min，在2～8℃下以12000r/min离心5min，取上清待检。

1.4 微量血凝试验（HA）

取干净的96孔微量反应板一块，操作如下：（1）用微量移液管向微量反应板第1行每孔加入PBS25μl；（2）微量移液器吸取禽流标准H5抗原25μl加入孔1，用移液器反复吹打8～10次混匀，吸取25μl于孔2，再次吹打混匀后吸取25μL于孔3，如此依次稀释到孔11，孔11混匀后吸出25μl弃掉，换吸头。孔12不加抗原，只加PBS做红细胞对照；（3）每孔再加PBS25μl；（4）每孔各家体积分数为1%鸡红细胞悬浮液（充分摇匀）加入25μl立即置微量振荡器上混匀1～2min。置20～25℃条件下静置20min后观察结果。红细胞对照孔将成明显的纽扣状沉到孔底。

结果判定：将微量反应板倾斜45度观察红细胞有无呈泪滴状流淌，完全血凝（不流淌）的抗原最高稀释倍数代表一个血凝单位（HAU）。

1.5 微量血凝抑制试验（HI）

取干净的96孔微量反应板一块，操作如下：（1）根据血凝试验的测定结果配置4HAU的病毒抗原。以完全凝集的病毒最高稀释倍数作为终点，重点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原稀释倍数。（2）用微量移液器自第1列孔至第11列孔加入25μlPBS，第12列孔加入25μlPBS。（3）用微量移液器吸取被检血清25μl加入第1列孔，用移液器反复吹打8～10次混匀，吸取25μl于第2孔，再次吹打混匀后吸取25μl于孔3，如此依次稀释到第10孔，混匀后吸出25μL弃掉。（4）1～11列孔均再加入含4个血凝单位抗原液25μl，第12列孔为红细胞对照，不加抗原。（5）立即置振荡器上振荡混匀1～2min，于22～25℃条件下静置感作20min。（6）每孔再加入1%鸡红细胞悬浮液25μl（混匀后加入），置振荡器上振荡1～2min，于22～ 25℃条件下静置感作20分钟后判定结果。红细胞对照将成明显的扣状沉淀到孔底。（7）每次试验应设已知滴度的阳性血清、阴性血清、红细胞对照和抗原对照。

结果判定：

将反映板倾斜45°，沉于孔底得红细胞沿着倾斜面向下呈线状流动者为沉淀，表明红细胞未被或者不被抗原凝集；如果孔底得红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被抗原凝集。

检查各种对照：阴性对照孔血清滴度不大于22，阳性对照孔血清误差不超过一个滴度，红细胞对照无血凝现象检查结果才有效。HI效价小于或等于23判定HI试验阴性；HI效价等于24可疑，需重复试验；HI效价大于或等于24为阳性。

在对照出现正确的情况下，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该血清的血清抑制滴度。能将4单位抗原凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清稀释倍数表示。

1.6 琼脂糖凝胶免疫扩散试验（AGID）

（1）打孔：用打孔器在琼脂板上按6角图案打孔，孔径、孔距为3mm，琼脂面朝上，玻片在酒精灯上过两遍，烫手即可，以防琼脂凝胶与玻片间有空隙，使样品漏出。（2）加样：用微量移液器吸取琼脂抗原滴加入中间孔，阳性血清加入周围1，4空中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔（2，3，5，6）每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品换一个吸头。（3）作用：加样完毕后，静置5～10分钟待孔中液体吸干后，将培养皿轻轻放入加盖湿盒内于37℃恒温培养箱中作用24～72h分别在24h、48h、72h对光观察结果，并记录。

结果判定：

阳性：阳性血清与抗原孔之间有明显致密的沉淀线时，被检血清与抗原之间也形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线末端向毗邻的被检血清孔内侧弯者，此被检血清判定为阳性（+）

弱阳性：被检血清与抗原孔之间没有沉淀线，但阳性血清的沉淀线末端被检血清孔偏移。此被检血清判定为弱阳性（需重复试验）如重复试验还是弱阳性，则判为阴性（-）。

阴性：被检血清与抗原孔之间不形成沉淀线，或者阳性血清的沉淀线向毗邻的被检血清孔直伸或向外侧偏弯者，此被检血清判定为阴性（—）。

1.7 酶联免疫吸附试验（ELISA）

（1）取酶标板（根据样品多少可拆开分次使用），将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，洗板1次（200μl/孔）后拍干；（2）加入待检样品，每孔100μl，同时设阴、阳性对照孔，每孔100μl，各1孔，置36～38℃作用30min；（3）洗涤5次，每次200μl/孔，每次约3min；（4）加入一抗（兔抗AIV-NP），100μl/孔，置36～38℃作用30min；（5）洗涤5次，每次200μl/孔，每次约3min；（6）加入羊抗兔IgG酶标抗体，100μl/孔，置36～38℃作用30min；（6）洗涤5次，每次200μl/孔，每次约3min；（7）每孔加底物液A、底物液B各一滴（约50μl），混匀，室温（20～25℃）避光显色10min；（7）每孔加入终止液一滴（约50μl），混匀后测定结果。

结果判定：在酶标仪上测各孔的OD630nm值。试验成立的条件是：阳性对照孔的OD630nm值≥0.8，且≤2.0；阴性对照孔的OD630nm值＜0.2。样品OD630nm值＞0.3时判为阳性；样品OD630nm值≤0.3时判为阴性。

2 结果与分析

2.1 微量血凝抑制试验（HA）结果

两组各20只40日龄鸡实验结果批次差异不大，最小6，最大9，说明2个种鸡场之间的免疫水平相差不大，该公司对种鸡禽流感的预防工作观念和认识存较高，2个种鸡场的免疫程序做的也较好。

2.2 琼脂糖凝胶免疫扩散试验（AGID）结果

AGID检测结果：用标准AI高免血清与40份待检样品做AGID试验，所检测的样本均含有流感病毒抗体。

2.3 酶联免疫吸附试验（ELISA）结果

ELISA检测结果：两组各20只40日龄鸡ELSA血清OD630值，试验结果都为阳性，OD值大多都超过0.7。

3 讨论

禽流感，特别是高致病性禽流感，自从被发现以来，给养禽业造成了巨大的损失，由于禽流感病毒自身这些毒株已经发生了变异，其基因序列氨基酸已经发生了两重甚至是三重的重组，有传染给人的潜在威胁，而且各亚型在陆禽和水禽之间的相互传播更加快了病毒基因的重组，这种重组给目前禽流感亚型的防制带来了困难，可能会在下次的流感大流行中扮演重要角色，所以加强亚型毒株的变异株的监测意义。

本次试验通过对山山东省聊城市的两家种鸡场进行HI、AGID、ELISA等试验检测，研究该地区禽流感发病情况。试验结果显示：两个种鸡场鸡群都具有较高禽流感的抗体，HI效价都大于4log2，即免疫合格。因此可以判定，两家种鸡场禽流感的免疫效果较好，无禽流感的发病情况。

[1]季大平，李超，刘立涛.山东省部分地区产蛋鸡群低致病性禽流感免疫状况调查[J].Shandong Journal of Animal Sciences& sveterinary Medicine，2013，（3）：48-49.