鉴定松材线虫病的形态学方法

张斌善，熊小娟，付　园，汤虎春

(汉中市林业工作中心，陕西 汉中)



鉴定松材线虫病的形态学方法

张斌善，熊小娟，付园，汤虎春

(汉中市林业工作中心，陕西 汉中)

摘要：介绍了松树毁灭性病害——松材线虫病预防监测过程中取样、分离、镜鉴等环节的技术方法。

关键词：松材线虫病；取样；分离；镜鉴

松材线虫病是由松材线虫寄生在松树体内所引起的一种毁灭性病害,被国家列为头号检疫对象。松褐天牛是其主要媒介昆虫，具有较强自然扩散能力。疫木及其制品随交通工具传播是造成其大范围扩散的根本原因。要防止松材线虫病的扩散蔓延，实现第一时间发现，当年基本拔除疫点，必须做好预防工作。对松材及其制品的复检和定期开展普查是做好预防工作的主要途径。市、县森防机构是预防工作的前沿，经常要对复检、普查采集到的样品进行鉴定。高等院校、科研机构通常用采用成本很高的PCR进行鉴定，市、县级森防机构多不具备PCR鉴定条件，大多采用形态学方法，只要操作正确，注意细节，也会得到十分准确的结果。

1取样

1.1松树的取样选择

1.1.1死亡原因不明的枯死松树在重点监测区域，遇到死亡原因不明的枯死松树，都应采样。死亡原因明确且并非由松材线虫引起的死亡，无需取样，如机械损伤、烂皮病诱发的次期害虫危害、火灾、华山大小蠹等引起的死亡，不用取样。

1.1.2死亡时间超过1 a、无论何种原因致死的松树都会有大量腐生线虫存在，尽可能选择刚枯死或尚未完全枯死的优势木(针叶呈黄绿或黄褐色，树皮未脱落，材质未腐朽)。对于枯死时间超过1 a的松树，如果需要取样,应当取心材，而不要取边材。

1.2取样部位

整株枯死的松树，在树干上(主侧枝交界处)、中、下(胸高处)三个部位取样。

1.3取样方式

1.3.1块状取样对可疑病树，采取块状取样方法，在取样部位采集木质部100～200 g，为避免钻取木屑时温度超过50℃、迅速杀死松材线虫，不能采取手钻钻取取样。复检松材及其制品时，应首先了解原产地，若来自情发生区，需尽可能块状取样，为避免样品少分离不出线虫，样品质量应大于200 g。

1.3.2手钻取样对于无法块状取样，可用较大手钻取样，手钻越小，取样造成的线虫死亡数量就越多。

1.4 标记

在样品上及时贴上标签(包括样品编号、采集地点、货物名称、树种、树龄、采集时间等)。

2分离

对采集的样品及时进行分离和鉴定，正确的分离方法是及时发现松材线虫病疫情的重要环节之一。

2.1分离的原理

线虫个体小、身体密度大于水，可穿过纱布、高级面巾纸，受重力作用会下沉，且具有向水性，遇水会从植物体或媒介昆虫体内游出。

2.2分离方法

采用漏斗法分离。首先把块状或段木样品的心材加工成黄豆大小颗粒(手钻所取样品不必加工)，再用双层纱布或高级面巾纸包好，置于漏斗内，加满清水进行分离，时间一般认为12 h。夏季气温高、线虫活跃，分离需时较短，分离2 h后，就可以用手持放大镜通过漏斗颈观察是否有线虫游出，如果观察到线虫数量较多，则4～8 h就可以用来镜鉴；如果线虫数量较少，可以分离12～24 h，也可将段木短时间浸水后，保湿培养2～3 d重新分离；冬季温度较低、线虫不够活跃，分离需时24～48 h。如果线虫数量较少，又不具备培养条件，可多采几次样，多次分离。

3镜鉴

3.1取分离液

松开止水夹从漏斗下的胶皮管内取分离液置于小烧杯内，最好不要超过2 mL，分离液太多，线虫密度变小，镜下不易观察。若线虫密度过大，可加清水稀释。

3.2做临时玻片

用胶头吸管从烧杯内吸少量分离液，滴一滴于干净的载玻片上，然后在10×4倍显微镜下观察有无线虫。如果没有线虫，基本可以排除松材线虫病。如果线虫较多，则应在酒精灯上来回移动约6 s，把线虫杀死，再加盖盖玻片。不能先盖玻片，再杀死线虫，原因是加盖玻片后，盖玻片下液体很少，加热时瞬间就可以把线虫组织熔化，无法进一步观察。

3.3镜鉴

先在10×4倍微镜镜下观察，看到线虫后，调到10×10倍微镜镜下，转动微调旋钮，到观察清楚为止。10×10倍镜下能清晰的看到口针、中食道球、雄性生殖器。如果没有口针，说明是腐生线虫。如果有口针、中食道球、雄性生殖器(弓形)，说明有可能是松材线虫或拟松材线虫，需进一步观察。通常微镜镜下都能观察到腐生线虫、幼虫(看不到生殖器)，少量成虫。在10×10倍微镜镜下，看到的松材线虫或拟松材线虫雄成虫尾部呈鱼钩状，雌成虫的虫体接近直线，大约在尾部1/3至1/4(阴门处)略弯曲。

松材线虫和拟松材线虫雄成虫在形态上几乎完全相同，因此在做形态鉴定时重点观察雌虫。在10×10倍微镜镜下选择雌成虫，放在视野中间，再调到10×40倍下观察。如果没有阴门盖，就可以排除松材线虫，如果有阴门盖，则是松材线虫或拟松材线虫。最后观察线虫的尾部。尾部和阴部有时在同一视野内，也应针对尾部用微调调整焦距，进行观察，因为其尾部和阴部不在同一平面内。拟松材线虫都有尾突，且长度超过2 um，松材线虫则短于2 um。实际操作过程中，这一特征很难把握。在松材线虫雌性群体中，有很大一部分个体尾部呈指圆形，其尾突自然就小于2 um。在10×40倍镜下看到有阴门盖，并且尾部呈指圆形的雌成虫,就可以确定为松材线虫。为了避免争议，对观察结果要在显微镜下拍摄成图片，存档。是否为松材线虫病，最终由国家公布的权威机构确定。

Identification of Pine Wilt Disease through Morphological Method

ZHANG Bin-shan, XIONG Xiao-juan, FU Yuan, TANG Hu-chun

(HanzhongForestryWorkCenter,Hanzhong,Shaanxi723000)

Abstract:Pine wilt disease (Bursaphelenchus xylophilus) is serious damaging disease to pine trees. Identification of it through morphological method was described regarding sampling, separation and identification under microscope.

Key words:Bursaphelenchus xylophilus; sampling; separation; identification under microscope

中图分类号:S763.3

文献标识码:A

文章编号:1001-2117(2016)02-0116-02

作者简介：张斌善( 1962-)， 长期从事森林病虫害防治。

收稿日期：2015-07-18