雪旺细胞移植改善心肌梗死后副交感/交感神经重塑

金培峰，张浩，陆地，翁家侃，姜盛，孙成超

（1.温州医科大学附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325015；2.中国医学科学院阜外心血管病医院,北京 100037）



雪旺细胞移植改善心肌梗死后副交感/交感神经重塑

金培峰1，张浩2，陆地1，翁家侃1，姜盛1，孙成超1

（1.温州医科大学附属第一医院 心胸外科，浙江 温州 325015；2.中国医学科学院阜外心血管病医院,北京 100037）

[摘 要]目的：对心肌梗死后的心脏进行雪旺细胞（Schwann cells）移植，从而改善心肌梗死的心脏神经的重塑，降低心肌梗死后室性心律失常易感性，以达到雪旺细胞移植治疗心肌梗死后心率失常的目的。方法：利用结扎Lewis大鼠冠状动脉前降支的方法建立急性大鼠心肌梗死模型，并将心肌梗死的大鼠随机分为细胞移植组（n=31）和对照组（n=30）。雪旺细胞取自大鼠坐骨神经，经爬片S100染色鉴定雪旺细胞表面标记物。并将经体外培养扩增后的雪旺细胞（5×106）通过注射的方式移植于心肌梗死周边区，并在细胞移植后的2周用免疫荧光及免疫组织化学方法检测心肌梗死边缘区副交感、交感神经，动态心电图和程序性电刺激（PES）检测室性心律失常的易感性。结果：通过S100染色发现，培养获得的雪旺细胞纯度达到95%以上，在雪旺细胞移植后的2周，免疫组织化学和免疫荧光结果显示，雪旺细胞移植能够显著改善心肌梗死边缘区副交感/交感神经的比例，并且能够显著降低动态心电图频域检测中低频/高频的比值，同时显著降低了室性心律失常的易感性。结论：雪旺细胞移植能够有效改善心肌梗死部位副交感/交感神经的比例，从而降低心肌梗死后室性心律失常的发生率。

[关键词]心肌梗死；室性心律失常；雪旺细胞；细胞移植

心脏的自主神经系统在调节心脏的节律中发挥重要的作用，主要由交感神经和副交感神经组成。致命的室性心律失常（室性心动过速、心室纤颤）是心肌梗死后的常见的致死性并发症之一[1]。但在心肌梗死后发生心律失常的患者中，心肌梗死周边区的病理性过度生长的交感神经与室性心律失常和心源性猝死的发生密切相关[2]，但是目前治疗心肌梗死后室性心律失常的手段十分有限，并存在着各种不足。雪旺细胞（Schwann cell）作为髓鞘的组成部分在神经的重构和神经轴突的生长过程中起着至关重要的作用，其机制主要是形成髓鞘对轴突提供物理支持，释放多种神经生长相关的物质来刺激并诱导神经轴突的定向性生长[3-4]。然而在急性心肌梗死的早期，心肌梗死部位急性缺血低氧的微环境造成了心肌内大量雪旺细胞的死亡，由于神经纤维的再生能力减弱，从而导致交感和副交感神经的不平衡重构产生。本研究旨在利用雪旺细胞具有促进轴突再生，恢复神经支配作用和改善再生神经纤维与细胞间作用的特点，来对心肌梗死后的心脏进行雪旺细胞移植，从而改善心肌梗死后心脏神经的重塑，降低心肌梗死后室性心律失常易感性，以达到雪旺细胞移植治疗心肌梗死后心率失常的目的。

1　材料和方法

1.1材料 Lewis大鼠由温州医科大学实验动物中心提供，所有研究都经实验动物委员会批准，本实验流程见图1。

图1　本实验流程图

1.2方法

1.2.1大鼠心肌梗死模型的建立：制作动物模型的方法和本研究组实验室以前的方法[5]相同。结扎Lewis大鼠左室前降支近端来制作心肌前壁梗死模型。当大鼠完全麻醉后，用16 G的静脉留置针制作成气管插管，经口气管插管接呼吸机机械通气，给氧、左侧第四肋间进胸。显露出心脏，用5-0 prolene线结扎冠状动脉的前降支，当看到结扎部位的远处心肌颜色由粉红变为苍白，并且心电图机上显示ST段抬高波形，标志大鼠心肌梗死模型制作成功。切口用丝线逐层缝合。心肌梗死模型完成后大鼠被随机分成细胞移植组（cell transplantation，n=31）及对照组（control，n=30），为获得基线数据设置假手术组（shame，n=5）。

1.2.2雪旺细胞的分离培养及鉴定：在无菌条件下取15只体质量为50～80 g的Lewis大鼠对其进行分离双侧坐骨神经，并在显微镜下仔细剥离坐骨神经的外膜及结缔组织，再用眼科显微剪刀将坐骨神经纤维剪成颗粒状，每个约2～3 mm3大小，并且在室温条件下，将神经纤维颗粒用0.25%胰蛋白酶+ 0.125%胶原蛋白酶消化15 min[6]，再将神经纤维颗粒1 000 r/min离心6 min。并准备好雪旺细胞培养基：DMEM培养液+10%牛血清+2 μmol/L福斯高林（for-skolin，Sigma Aldrich，USA）+20 mg/L牛脑垂体提取液（bovine pituitary extract，Sigma Aldrich，USA）。最后将离心后的沉淀物再次悬浮于培养基中，并在37 ℃下通以5% CO2的培养箱内进行培养。通过S100染色对雪旺细胞进行鉴定，即培养的雪旺细胞达到70%～80%融合之后，将细胞爬片于玻片上继续生长，贴壁完成后用S100对细胞进行免疫组织化学染色并在显微镜下进行观察，S100的具体染色方法见免疫组织化学部分所示。

1.2.3雪旺细胞移植：细胞移植组大鼠在心肌梗死后30 min进行雪旺细胞移植。具体操作如下：在细胞移植前，用DAPI（Sigma，USA）标记细胞用以示踪，用29号胰岛素注射器（BD，USA）抽取50 μL 含5×106雪旺细胞的悬液，并在心肌梗死周边区分四个点将细胞悬液分别均等地注入心肌内，心肌梗死区部位的辨认同心肌梗死模型制作时的方法[5]。

1.2.4心功能的检测：动物在镇静状态下，于建立急性心肌梗死模型前进行二维超声心动图检测大鼠的心功能基线值，并且在成功建立急性心肌梗死模型（雪旺细胞移植后）2周后接受二维超声心动检查以检测细胞移植对心功能的影响。在双盲操作的模式下，所有超声心动检查均被重复3次。由心超机自动计算左室射血分数（left ventricularejection fraction，LVEF）、左室缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS），计算公式：LVFS（%）=（LVEDd-LVESd）/LVEDd×100，LVEF（%）=[（LVEDd3-LVESd3）/LVEDd3]×100。LVEDd：左心室舒张末期内径；LVESd：左心室收缩末期内径。

1.2.5动态心电图检测：在建立心肌梗死模型之前，将心电传感器（TA10EA-F20）埋入大鼠腹腔内，将传感器的正极和负极分别指向左下肢和右上肢位置，在细胞移植后的2周获取大鼠的24 h动态心电图[7]，并将数据利用ECG Auto 1.5.7（EMKA Technologies）软件分析，随机取其中的5 min心电数据进行心率变异性分析，其中将R波的波峰作为参数分析的时间位置[8]。时域（time domain）分析检测中，主要指标为相邻RR间期（NN-interval）均数、NN-interval的标准差（SDNN）、变异系数（100×SD of NN-interval/mean NN-interval），在频域的分析中主要采用的指标为：低频（LF，0.5 Hz＜LF＜0.8 Hz）、高频（HF，0.8 Hz＜HF＜4.5 Hz）和低频/高频（LF/HF）的比值。

1.2.6程序性电刺激：在建立大鼠心肌梗死模型的过程中将心外膜电极（Medtronic）预置在左室表面，并通过导线将电极埋于皮肤下，在心肌梗死后2周通过双盲的方法进行程序性电刺激检测[9]。室性心律失常的刺激主要通过心电刺激器来进行。程序电刺激的具体方案如下：先给予8次间隔相等（150 ms）的起搏刺激（S0），随后给予1次（S1）、2次（S2）或3次（S3）间隔逐渐缩短的额外刺激，以诱发心律失常。其中室性快速型心律失常包括室速和室颤，心律失常指数的计算通过以往的文献报道的研究方法来获得。

1.2.7免疫组织化学和免疫荧光：在心电检测和心功能检测完成后处死大鼠，取下心脏分别进行石蜡切片和冰冻切片以进行免疫组织化学和免疫荧光检测。为对雪旺细胞的细胞玻璃爬片和心肌标本切片进行S100染色，首先将玻片置于枸椽酸钠缓冲液中加热至95 ℃，并持续10 min，用PBS缓冲液清洗3遍，而后用山羊血清封闭20 min，再加入S100一抗（Sigma，USA），在4 ℃过夜之后，爬片用PBS液清洗，加入相应的二抗，在37 ℃下孵育40 min，再将爬片和切片放置于抗生物素蛋白链菌素中，在30 ℃下孵育4 h，最后使用硝基蓝四哇（nitroblue tetrazolium，NBT）进行显色。在心肌梗死后2周利用免疫荧光对酪胺酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）生长相关蛋白43（growth associated protein43，GAP43）、乙酰胆碱酯酶（acetylcholin esterase，AchE）、S100进行标记，检测抗体包括TH（1:200，AbcamInc）、GAP43（1:500，AbcamInc）、AchE（l:2 000，AbcamInc）、S100（Sigma）。将事先切好的冰冻切片从冰箱中取出，用冷丙酮4 ℃固定10 min，并用PBS清洗3次，每次3 min。再滴加10%的山羊血清孵育30 min，弃去血清，不洗，滴加相应浓度的上述一抗150 μL，4 ℃过夜。PBS液洗清后滴加相对应于一抗的荧光二抗，完成后立即于荧光显微镜下观察拍摄，拍摄完毕后放置于-20 ℃的冰箱中储藏。切片和玻片用Olympus DP70拍摄后，用ImagePro Plus 5.0软件进行电子成像系统分析，神经纤维密度计数方法为：在双盲模式下用40×显微视野进行神经纤维密度的计数，随机选取5个视野，并计算染色阳性面积（μm2）与40×显微视野面积之比（μm2/mm2）。

1.3统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计学分析。连续变量的数据表述方式为±s，变量的比较采用t检验，非连续变量表述为百分比；程序性电刺激的数据比较使用Kruskal-Wallis检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1雪旺细胞的体外鉴定及死亡率 将雪旺细胞S100染色切片在相差显微镜下，可观察到雪旺细胞核为卵圆形，在细胞的两极各有一个突起的梭形细胞，S100染色阳性，而本实验中所采用的细胞S100阳性率达到95%以上。

2.22组大鼠心功能及死亡率比较 2组心功能在急性心肌梗死前各项指标（基线水平）差异无统计学意义（P＞0.05）；心肌梗死2周后2组大鼠的心功能指标较基线水平明显恶化，2组大鼠间心功能和死亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.3免疫组织化学及免疫荧光 心肌梗死后2周对照组和细胞移植组S100阳性的细胞显著增加，但DAPI标记的雪旺细胞在移植后能够显著地刺激移植部位S100阳性细胞增加，见图2。免疫荧光检测显示心肌梗死后心肌梗死周围的交感和副交感神经的密度显著地增加。心肌梗死2周后，细胞移植组副交感/交感神经纤维的比率较对照组显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3和表2。

表1　2组大鼠心功能检测（±s）

A：假手术组的S100阳性细胞；B、C：心肌梗死2周后细胞移植组和对照组均可发现S100阳性细胞的增生；D 心肌梗死2周后DAPI标记的雪旺细胞在心肌组织的显像；E：细胞移植组S100染性阳性的细胞；F：细胞移植2周后，细胞移植组DAPI标记的雪旺细胞能够促进移植部位的S100阳性的细胞增生。白色箭头为S100阳性的细胞，黄色箭头为经DAPI染色的移植后雪旺细胞，红色箭头为DAPI标记的雪旺细胞S100染色阳性，绿色箭头为除移植的雪旺细胞以外S100阳性的细胞图2　心肌梗死后2周各组心肌中S100阳性细胞的分布

2.4动态心电图检测和程序性电刺激结果 心肌梗死2周后在心率变异系数的检测中，细胞移植组的低频/高频（LF/HF）的比值显著地低于对照组（P ＜0.05）。程序性电刺激诱导的室性心律失常的检测发现，细胞移植组室性心律失常指数显著低于对照组（P＜0.05），见表3和图4B。

白色箭头提示TH染色阳性的神经纤维，黄色箭头提示为AChE染色阳性的神经纤维，粉色箭头表示GAP43染色阳性的神经纤维。心肌梗死2周后在细胞移植组和对照组均观察到神经纤维的增殖图3　心肌梗死2周后心肌梗死周边区的神经纤维免疫荧光染色

表2　心肌梗死2周后梗死周边区的神经纤维密度（±s）

3　讨论

心肌梗死后梗死周边区的交感神经过度增生和支配以及与之相伴的室性心律失常的发生是影响心肌梗死患者早期生存的重要因素之一，而雪旺细胞在心肌梗死后的神经重构中起着至关重要的作用，但是在心肌梗死部位雪旺细胞的数量却大大降低[10]。在本研究中，我们将雪旺细胞移植入大鼠心肌梗死部位去补充因心肌梗死丢失的雪旺细胞，从而达到神经再生的目的。本研究得出以下结果：①雪旺细胞移植能够促进神经的再生，并且改善副交感/交感神经的比例，但是雪旺细胞移植对于心功能的改善无益；②雪旺细胞移植后大鼠的心率变异性的高频/低频比值和室性心律失常的易感性显著地降低。

表3　动态心电图检测结果（±s）

与对照组比：aP＜0.05。inducibility quotient：诱导系数A.程序性电刺激诱发室性心律失常的典型心电图表现；B.移植组室性心律失常指数显著低于对照组图4　雪旺细胞移植降低心肌梗死后室性心律失常易感性

既往的研究表明，雪旺细胞在脊髓和外周神经损伤的修复中起着重要的作用，主要机制是通过轴索和髓鞘的修复[11]。另外雪旺细胞能够在神经损伤部位促进巨噬细胞的趋化作用。因此在本研究中，将雪旺细胞移植到心肌梗死周边区后能够使巨噬细胞快速趋化到坏死部位，并且使其快速而有效清除细胞碎片，为神经轴突生长提供良好的微环境，从而刺激神经的再生[12-13]。另外GAP43是一个轴突膜蛋白，为神经特异性的蛋白质，在神经细胞生长、再生及突触的发育中发挥重要的作用，并且其在神经元发育和再生过程中以高水平表达。本研究发现，在雪旺细胞移植组的心肌梗死周边区GAP43表达显著增高，也提示雪旺细胞在移植后有效地参与了移植部位神经的修复和再生。

另外急性心肌梗死后，心肌梗死周边区的交感神经过度生长和支配是导致室性心律失常和心源性猝死发生的重要原因之一。而与之相对应的，在Ando等[14]的研究中发现，通过刺激副交感神经能够有效地降低心肌梗死后室性心律失常的发生。因此本研究试图利用雪旺细胞具有神经损伤修复这一生物学特性，将雪旺细胞通过局部注射的方法移植入心肌梗死周边区来促进心脏交感神经和副交感神经的平衡生长。另外Cao等[2]研究发现，心脏交感神经的过度增殖和自主神经的不均衡生长基本上发生在心肌梗死周边区，因此我们选择在心肌梗死周边区注射雪旺细胞。在本研究中，尽管雪旺细胞移植能够同时促进心肌梗死周边区交感和副交感神经纤维的生长，但是通过与对照组对比发现，细胞移植组的副交感神经的增长速度得到了显著的提高，因此细胞移植组的副交感/交感神经纤维密度比值较对照组显著增高。这也提示，雪旺细胞移植能够有效改善副交感/交感神经纤维的不均衡生长现象，降低了心律失常的易感性，进而减少了室性心律失常的发生。

在本研究中，利用动态心电图检查及程序性电刺激来评估雪旺细胞移植后大鼠抗心律失常的能力。可能由于大鼠心率偏快的原因，虽然在R-R间期及心率变异性的检测中，本研究组并没有得到改善的结果，但是在高频的检测中发现其比例增加，因为低频/高频的比值的降低反映副交感神经的活动，因此意味着副交感神经的增生在其中起着重要的作用[15-16]。同时在雪旺细胞移植后2周，在程序性电刺激的检测中，室性心律失常的易感性降低也证实了雪旺细胞移植在改善神经重构中的作用。

相比较干细胞移植能够有效改善心肌梗死后的心功能，虽然既往已有的研究证实雪旺细胞移植后能够增加血管内皮生长因子（vascular endothelial qrowth factor，VEGF）的表达并促进血管新生，但是在本研究中我们并未发现雪旺细胞移植对改善心功能有效。但是根据既往的临床和动物实验结果，本研究组认为，雪旺细胞可以联合其他细胞移植改善心肌梗死后心功能，并同时减少因细胞移植引起或心肌梗死本身引起的室性心律失常的发生，如联合成肌细胞移植用于心肌梗死后心功能衰竭的治疗过程，同时能减少因成肌细胞移植而造成的心律失常[17-18]。此外，雪旺细胞作为一种终末分化的细胞在临床上很容易获得，另外也可以通过自体的成体干细胞进行培养分化而来（如骨髓间充质干细胞分化可以诱导分化为雪旺细胞），因此雪旺细胞移植治疗心肌梗死后室性心律失常具备较好的临床应用前景，将来我们将对雪旺细胞移植改善心肌梗死后副交感/交感神经纤维比例的相关分子生物学机制进行深入的研究。

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（本文编辑：吴彬）

·论 著·

Remodeling of parasympathetic/sympathetic ratio in the infarcted myocardium after Schwann cell trans-plantation

JIN Peifeng1,ZHANG Hao2,LU Di1,WENG Jiakan1,JIANG Sheng1,SUN Chengchao1.1.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,the First Affl iliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 2.Fu Wai Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Beijing,100037

Abstract:Objective:To investigated the feasibility of remodeling nervous system regeneration after myocardial infarction and the effi cacy by which it may prevent ventricular arrhythmia following Schwann cells transplantation.Methods:Myocardial infarction was induced by left anterior descending artery ligation in syngenic Lewis rats,then the rats were randomized into cell transplantation group (n=31) and control group (n=30).Schwann cell were isolated from sciatic nerves,and immunohistochemical of S100 was carried out for the identifi cation of Schwann cells.5×106Schwann cell were intramyocardially injected into the border zone of infarct region.The density of sympathetic and parasympathetic nerves and growth-associated protein 43 in the infarct region were stained by immunohistochemical method and immunofl uorescence at 2 weeks after Schwann cells transplantation.Meanwhile,dynamic electrocardiography and programmed electric stimulation were also performed to detect the susceptibility of ventricular arrhythmias.Results:More than 95% of cells were S-100-positive Schwann cells during the entire culture process.Immunohistochemical and immunofl uorescence staining illustrated increases in sympathetic and parasympathetic nerves in both groups.However,Schwann cells transplantation signifi cantly increased the parasympathetic/sympathetic ratio at 2 weeks after cell injection.In addition,the Schwann cells also signifi cantly decreased the low-/high-frequency ratio and susceptibility of programmed electric stimulation-induced ventricular arrhythmia at 2 weeks after cell injection.Conclusion:Transplanted Schwann cells in the infarcted myocardium can alter the ratio of parasympathetic/sympathetic nerve density to normalize irritable myocardium.

Key words:myocardial infarction; ventricular arrhythmia; Schwann cells; cell transplantation

通信作者：孙成超，主任医师，硕士生导师，Email：suncc6@ 163.com。

作者简介：金培峰（1984-），男，浙江乐清人，主治医师，硕士。

基金项目：浙江省自然科学基金资助项目（Y2110641）。

收稿日期：2015-09-28

[中图分类号]R541.7

[文献标志码]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.01.003